聚酮合酶基因簇cluster9和Aureothin生物合成基因簇中調(diào)控因子AurD的研究.pdf

1、聚酮化合物種類(lèi)繁多，通常具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、免疫抑制等多種生物活性，因而引起人們的廣泛關(guān)注。聚酮化合物的碳鏈骨架由聚酮合酶催化。不同類(lèi)型聚酮化合物生物合成途徑的揭示，將為未來(lái)發(fā)現(xiàn)乃至創(chuàng)造新型聚酮化合物的研究指明方向。本研究以?xún)蓚€(gè)聚酮合酶基因簇為研究對(duì)象，利用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)的研究方法，對(duì)基因簇的功能及調(diào)控進(jìn)行了探索。
　　1鏈霉菌SH-62基因組中聚酮合酶基因簇cluster9的研究
　　來(lái)自鏈霉菌SH-

2、62的聚酮合酶基因簇cluster9屬于Ⅰ型PKS，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的天然產(chǎn)物合成基因簇同源性較低，可能是一個(gè)新的天然產(chǎn)物生物合成基因簇。包含有聚酮合酶基因簇cluster9的BAC質(zhì)粒在Streptomyces albus中異源表達(dá)產(chǎn)生3個(gè)疑似的代謝產(chǎn)物。為了檢測(cè)這3個(gè)化合物與cluster9的相關(guān)性，采用兩種基因組編輯方法，包括λ-Red介導(dǎo)的PCR-targeting系統(tǒng)和CRISPR/Cas9-CodA(sm)系統(tǒng)，對(duì)cluste

3、r9中的核心pks基因進(jìn)行了敲除。發(fā)現(xiàn)核心基因的敲除沒(méi)有影響3個(gè)化合物的合成，說(shuō)明它們并不是cluster9的異源表達(dá)產(chǎn)物。
　　2Aureothin生物合成基因簇中調(diào)控因子AurD的研究
　　Aureothin是具有良好生物活性的硝基芳香類(lèi)抗生素，在其生物合成基因簇中只發(fā)現(xiàn)了一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aurD。敲除aurD基因會(huì)阻斷aureothin的合成過(guò)程，而aurD基因的回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)一直無(wú)法成功?？紤]到aurD基因的過(guò)量表達(dá)

4、可能會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此本研究采用了基因原位回補(bǔ)的方法，將安裝有組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*的aurD基因重新插入到原基因的敲除位點(diǎn)，成功獲得了基因回補(bǔ)突變菌株。回補(bǔ)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物分析證實(shí)aurD基因的回補(bǔ)能夠恢復(fù)aureothin的產(chǎn)生，并且因?yàn)榻M成型強(qiáng)啟動(dòng)子增強(qiáng)了aurD基因的表達(dá)使得aureothin產(chǎn)量顯著提升，進(jìn)一步地證實(shí)了aurD對(duì)aureothin生物合成的正調(diào)控效應(yīng)。
　　AurD具有一個(gè)OmpR類(lèi)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域