殼寡糖調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬抑制泡沫化作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種進(jìn)行性多病灶的脈管系統(tǒng)炎癥性疾病，與高血脂、高血壓、糖尿病以及肥胖等疾病具有密切聯(lián)系，對(duì)全身各個(gè)重要組織器官均有影響。隨著動(dòng)脈粥樣硬化不斷發(fā)展，血管內(nèi)壁脂質(zhì)堆積、炎性反應(yīng)和血管壁異常重建逐漸增多，使血管內(nèi)膜增生形成斑塊;在動(dòng)脈粥樣硬化后期，這些斑塊非常不穩(wěn)定，容易破裂并脫落形成動(dòng)脈血栓，這是導(dǎo)致急性心血管事件的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，其影響因素眾多，脂質(zhì)和膽固醇代謝異常對(duì)于促進(jìn)動(dòng)脈

2、粥樣硬化斑塊形成發(fā)揮了重要作用。巨噬細(xì)胞吞噬大量脂質(zhì)形成的泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的主要成分，同時(shí)也是導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。增強(qiáng)巨噬細(xì)胞自噬，促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞中膽固醇外排、抑制ox-LDL攝取對(duì)于抑制泡沫細(xì)胞形成，減緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和減少粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性具有十分重要的意義。殼寡糖是一類天然堿性多糖，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性，包括抗炎、抗腫瘤、抗病毒以及抗阿爾茲海默病等。本研究主要為了考察殼寡糖對(duì)巨噬細(xì)

3、胞泡沫化和自噬的調(diào)控作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法：采用的是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞模型，通過油紅O染色、總膽固醇含量測定評(píng)價(jià)殼寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響;采用熒光標(biāo)記氧化型低密度脂蛋白(Dil-LDL)和25-NBD膽固醇檢測巨噬細(xì)胞ox-LDL攝取和膽固醇外流水平;使用Western blot技術(shù)來檢測膽固醇流入和流出相關(guān)蛋白(ABCA1、ABCG1、SR-A、CD36)以及自噬相關(guān)蛋白

4、(LC3Ⅱ/Ⅰ、P62)的表達(dá)水平，觀察殼寡糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬和泡沫化的影響;最后對(duì)自噬上游關(guān)鍵分子mTOR進(jìn)行特異性干擾，通過Western blot技術(shù)檢測p-mTOR、mTOR、LC3、p62等蛋白表達(dá)并且進(jìn)行定量分析，探討殼寡糖調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬可能的機(jī)制;最后通過油O染色技術(shù)和總膽固醇檢測試劑盒觀察自噬抑制劑3-MA對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化的影響，進(jìn)一步研究殼寡糖調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬與殼寡糖調(diào)控巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆

5、積和泡沫化的作用之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：200μg/ml的殼寡糖可以顯著抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平;殼寡糖顯著調(diào)節(jié)RAW264.7巨噬細(xì)胞中與膽固醇外排和吸收關(guān)鍵蛋白表達(dá)，抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)堆積和泡沫化。200μg/ml殼寡糖處理RAW264.7巨噬細(xì)胞12h后明顯上調(diào)細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平同時(shí)顯著下調(diào)P62水平，殼寡糖明顯提高RAW264

6、.7巨噬細(xì)胞中自噬活性。在探究殼寡糖促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬可能的分子機(jī)制時(shí)采用相應(yīng)的化合物干擾細(xì)胞自噬以及mTOR的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，選擇氯喹可以顯著降低殼寡糖促進(jìn)RAW64.7巨噬細(xì)胞自噬的作用，這是由于氯喹作為自噬抑制劑可以特異性抑制細(xì)胞內(nèi)晚期自噬;亮氨酸作為自噬抑制劑可以促進(jìn)mTOR的表達(dá)，在使用殼寡糖處理RAW264.7巨噬細(xì)胞的同時(shí)使用亮氨酸后檢測到mTOR磷酸化水平升高，并且殼寡糖上調(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞自