雙熒光細胞生物傳感器的構建及其在納米材料生物有效性評估中的應用.pdf

1、納米材料通常是特征尺寸在1-100 nm的極細材料，容易通過吸入，攝入及皮膚接觸進入生物體內(nèi)。納米材料的種類繁多，在涂料、催化劑、半導體、化妝品、食物添加劑、電子元件和藥物載體等商業(yè)化產(chǎn)品有著廣泛的應用。研究表明，隨著人體接觸納米材料的機會增加，納米材料作用于人體會導致一系列的生物學反應。因此，納米材料的生物安全性日益引起人們的關注。目前，納米毒理學還沒有建立一套獨立，完善的納米材料毒性評價方法，其主要檢測手段主要是借鑒傳統(tǒng)的環(huán)境有毒物

2、毒理學評價方法。而納米材料獨特的顆粒效應，亟需發(fā)展一種準確、高效、簡便、并適于納米材料毒性評估的檢測方法。本論文首先構建了以AP-1、BTG2、IL8啟動子為基礎的雙熒光報告質(zhì)粒（pAP1-MC-EGFP、pBTG2-MC-EGFP及pIL8-MC-EGFP），均以綠色熒光蛋白EGFP和紅色熒光蛋白mCherry為報告基因，組成型啟動子(cytomegalovirus，CMV)控制下游的綠色熒光蛋白EGFP，而誘導型啟動子（AP-1、B

3、TG2或IL8啟動子）控制下游紅色熒光蛋白mCherry表達。組成型表達的EGFP用于監(jiān)測轉染效率，而誘導型表達的mCherry熒光信號用于精準反映啟動子的活性。將上述三種雙熒光報告基因質(zhì)粒分別轉染哺乳動物細胞，建立相應的細胞生物傳感器，用于反映致癌毒性、DNA損傷及炎癥反應。通過對細胞生物傳感器的優(yōu)化，成功將其應用于納米材料生物毒性效應的評估及環(huán)境因子對納米材料生物毒性效應的影響，初步探討納米材料暴露下細胞內(nèi)基因表達調(diào)控機制，從而為研

4、究納米材料影響胞內(nèi)特定基因的表達提供重要信息。同時，結合傳統(tǒng)的生物毒性檢測手段，采用細胞生物傳感器初步探究了納米氧化鈦的細胞毒性和基因毒性。本論文主要研究方結果如下:
　　1、本論文構建了新型的雙熒光報告質(zhì)粒pAP1-MC-EGFP、pBTG2-MC-EGFP、pIL8-MC-EGFP，分別建立傳感器細胞H1299-AP1、H1299-BTG2、H1299-IL8，通過比較細胞類型、培養(yǎng)條件、流式分析策略等對檢測結果的影響，對該細

5、胞生物傳感器檢測納米材料生物毒性的實驗體系進行了優(yōu)化。在檢測靈敏度和準確性等方面得到顯著提高。同時，與傳統(tǒng)的生物檢測方法（Western Blot、RT-PCR、免疫熒光細胞化學）得到的實驗結果相比，細胞生物傳感器檢測結果與其具有良好的一致性。
　　2、利用流式細胞術，將細胞生物傳感器成功應用于納米材料生物毒性的檢測。結果顯示，不同種類的納米材料引起的基因轉錄活性差異很大。其中，碳族納米材料基本不影響胞內(nèi)AP-1啟動子的轉錄活性，

6、而金屬及金屬氧化物納米材料增高了胞內(nèi)三種啟動子的轉錄活性，且存在濃度依賴性，具有較強的致癌性、DNA損傷、免疫炎癥反應等生物毒性。
　　3、金屬及氧化物納米材料在不同的環(huán)境因子（老化、UVA輻照、富里酸）影響下，其細胞毒性也發(fā)生了很大的改變。老化可能增加納米銀和納米氧化鈦的毒性風險;FA可能會降低納米銀和納米氧化鈦的生物毒性;UVA輻照對納米材料生物毒性的影響與材料種類有關。
　　4、結合傳統(tǒng)的生物毒性檢測方法，細胞生物傳感