姜黃素抑制MT1-MMP表達對乳腺癌MCF-7細胞增殖和侵襲的影響及淋巴管生成作用的研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占女性所有惡性腫瘤的30％，致死率居女性惡性腫瘤第二位。姜黃素是一種新型的抗腫瘤藥物，近年來研究發(fā)現它對乳腺癌等許多惡性腫瘤均有抑制作用。有研究表明，膜型基質金屬蛋白酶-1(membrane type-1matrix metalloproteinase，MT1-MMP)與乳腺癌腋窩淋巴結轉移呈正相關，而姜黃素與MT1-MMP的關系鮮有報道。因此，本研究選擇MCF-7細胞株構建過表

2、達MT1-MMP的乳腺癌細胞模型，研究姜黃素對乳腺癌MCF-7細胞MT1-MMP表達及淋巴管生成作用的影響，為其應用于乳腺癌的治療提供理論依據。
　　方法:
　　1.淋巴內皮細胞收集和培養(yǎng)
　　收集常規(guī)包皮環(huán)切術的包皮組織，分離消化后在內皮細胞培養(yǎng)基(EBM)培養(yǎng)，用Dil-ac-LDL標記淋巴內皮細胞，加入磁珠包被人源性LYVE-1抗體和免疫磁珠，利用磁珠收集器進行收集，用DNA酶消化后使淋巴內皮細胞與磁珠分離，淋巴

3、內皮細胞培養(yǎng)于基質膠包被的培養(yǎng)皿的內皮培基中，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　　2.表達MT1-MMP的MCF-7細胞株的建立
　　將MT1-MMP基因克隆至真核表達質粒pcDNA3.1，經測序鑒定后，用LipofectamineTM2000脂質體轉染入乳腺癌細胞MCF-7，轉染2天后，改用含G418的培養(yǎng)基篩選出能夠穩(wěn)定表達MT1-MMP的MCF-7細胞。試驗分以下三個組:未轉染組、空白質粒組、轉染組。即①MCF-7對照組;②M

4、CF-7+pcDNA3.1空白質粒組;③MCF-7/MT1-MMP轉染組，試驗時加入不同濃度姜黃素處理。
　　3.Western Blot檢測試驗組和對照組乳腺癌MCF-7細胞中MT1-MMP蛋白的水平;
　　4.分別用CCK8和Transwell測定不同濃度姜黃素對乳腺癌MCF-7細胞增殖和侵襲能力的影響;
　　5.乳腺癌MCF-7細胞株和淋巴內皮細胞聯(lián)合三維培養(yǎng)
　　將淋巴內皮細胞培養(yǎng)于基質膠(Matrige

5、l)包被的培養(yǎng)皿，待細胞生長至3/4融合后，覆蓋一層M199培養(yǎng)基配制的無細胞Matrigel;膠原聚合后，在其上覆蓋一層乳腺癌細胞株Matrigel。最表面再覆蓋一層內皮細胞培養(yǎng)基。在三維培養(yǎng)過程中，待細胞生長至對數生長期加入姜黃素處理。
　　統(tǒng)計學處理用SPSS21.0軟件完成，計量資料以x±s表示，多組數據參數間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用兩樣本SNK檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:<

6、br>　　1.MT1-MMP蛋白在乳腺癌MCF-7細胞中的表達
　　Western Blot實驗結果顯示，在未轉染組及空白質粒組未見明顯蛋白表達條帶，而在轉染組均出現MT1-MMP蛋白表達條帶，加入姜黃素后蛋白表達條帶變低。
　　2.姜黃素抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖和侵襲作用
　　CCK-8法和Transwell法實驗結果顯示:與未轉染組及空白質粒組比較，轉染組的細胞增值的能力增加且細胞侵襲數目增加，即表達MT1-M

7、MP蛋白的MCF-7細胞增殖和侵襲能力明顯增強，而在經姜黃素處理后其細胞增值能力降低且侵襲數目減少，表明其增殖和侵襲能力受到抑制，且這種抑制作用呈劑量依賴方式。
　　3.姜黃素抑制乳腺癌MCF-7細胞誘導的淋巴內皮細胞增生與淋巴管生成作用
　　熒光倒置顯微鏡觀察三維培養(yǎng)中各組淋巴內皮細胞在基質中生長情況結果顯示:各組乳腺癌細胞都能誘導淋巴內皮細胞增生并形成淋巴管狀結構，并且轉染了MT1-MMP的誘導能力更強，而經姜黃素處理后