Progranulin在高同型半胱氨酸血癥誘導的腎臟損傷中的作用.pdf

1、目的：
　　高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, hHcys)是導致終末期腎病(endstage renal disease，ESRD)的一個重要的危險因子和致病因素。近年來研究表明，hHcys能直接作用于腎小球，誘導腎小球功能紊亂，進一步導致腎小球硬化，最終發(fā)展為終末期腎病。腎小球內皮細胞、基底膜和足細胞共同構成了腎小球的濾過屏障，其中足細胞和腎小球內皮細胞對維持腎臟功能和濾過屏障的選擇通透性都具有十分

2、重要的作用。足細胞損傷可導致蛋白尿的產生，而腎小球內皮細胞功能紊亂可介導炎癥應答。但目前hHcys所致腎臟損傷特別是腎小球內皮細胞與足細胞損傷的機制尚未完全明確。
　　顆粒蛋白前體（progranulin，PGRN）是一種自分泌生長因子，由7.5個重復的同源性富含半胱氨酸顆粒蛋白區(qū)域組成。在上皮細胞、免疫細胞、神經細胞及軟骨細胞等多種細胞中廣泛表達，與細胞增殖、腫瘤生長、胰島素抵抗、神經退行性疾病、組織修復以及炎癥等多種病理生理學

3、進程密切相關。前期我們課題組研究表明，在急性腎臟損傷中PGRN能夠通過抑制炎癥保護腎臟，但PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導的慢性腎病中的作用，迄今未見報道。
　　研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與腎臟損傷有著密切的聯系，參與足細胞功能紊亂和蛋白尿形成等過程。為此，本實驗擬通過體內和體外兩方面來研究PGRN在hHcys誘導的腎臟損傷中的作用及其調控機制與Wnt/β-catenin信號通路有關。
　　方法與結果：

4、r>　　1.PGRN在高同型半胱氨酸誘導的腎臟損傷中的表達
　　使用8周齡的C57BL/6J野生雄性小鼠隨機分為兩組，小鼠單腎摘除一周后，無葉酸飼料（folate free diet，FF diet）喂養(yǎng)10周構建hHcys動物模型，正常飼料(normal diet，norm diet)作為對照。高效液相色譜法（high performance liquidchromatography，HPLC）檢測無葉酸飲食血漿總同型半胱氨酸(

5、total homocysteine，tHcys)含量升高，證明hHcys模型構建成功。酶聯免疫分析法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)檢測尿白蛋白/肌酐比值升高;過碘酸-雪夫染色(periodic acid-schiff stain，PAS)方法對小鼠腎臟石蠟切片進行染色和透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)的方法觀察腎臟足細胞損傷，hHcy

6、s模型腎臟中出現系膜基質增生，基底膜厚度不均，足突融合，提示腎臟功能障礙，腎小球出現損傷。ELISA檢測血漿中PGRN水平，發(fā)現血漿中PGRN降低。通過蛋白免疫印跡（western blot，WB）、免疫組織化學染色(immunohistochemistry，IHC)、免疫熒光(immunofluorescence，IF)雙染驗證PGRN在腎臟中表達變化和分布，在腎小球內皮細胞、足細胞和近曲小管中均有表達，在腎小球中PGRN表達降低。體

7、外實驗，使用L-型同型半胱氨酸(L-homocysteine，L-Hcys)刺激腎臟四種固有細胞腎小球內皮細胞(glomerular endothelial cell, GEnC)、腎小球足細胞（human podocyte，HPC）、系膜細胞(rat mesangial cell，RMC)及腎小管上皮細胞（human kidney2，HK-2），結果顯示PGRN在GEnC和HPC中呈現L-Hcys劑量依賴性降低。
　　2.PGR

8、N在高同型半胱氨酸血癥誘導的腎臟損傷中的作用
　　C57BL/6J野生雄性小鼠和Grn基因敲除小鼠(B6(Cg)-Gmtm1.1Aidi/J）雄性小鼠隨機分為四組，構建hHcys動物模型。檢測血漿tHcys，尿白蛋白/肌酐比值，并進行PAS染色和透射電鏡分析，結果顯示，PGRN缺失不影響無葉酸飲食誘導的血漿Hcys水平的變化，但加重高同型半胱氨酸血癥誘導的腎臟損傷。實時定量RT-PCR檢測腎臟中炎癥因子的表達、IHC檢測中性粒細胞

9、的標記物Ly6B和巨噬細胞的標記物CD68，結果顯示PGRN的缺失加重hHcys導致的炎癥應答及炎性細胞浸潤。WB、IF結果顯示，Grn基因敲除加重了hHcys介導的腎臟組織中足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin、podocin形態(tài)損傷，以及緊密連接蛋白occludin蛋白表達降低。體外實驗，WB、IF結果顯示，外源重組PGRN(recombinant PGRN，rPGRN)能逆轉Hcys誘導的腎小球內皮細胞間緊密連接蛋白閉合小環(huán)蛋白1（z

10、onula occludens-1，ZO-1）蛋白水平降低及形態(tài)的損傷。
　　3.PGRN在保護高同型半胱氨酸血癥誘導的腎臟損傷中的作用機制
　　高同型半胱氨酸血癥野生型及Grn基因敲除小鼠腎臟中的β-catenin的明顯活化。體外實驗中，L-Hcys能夠誘導GEnC和HPC中β-catenin的活化，而加入外源rPGRN則能抑制這一作用，說明PGRN可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來保護hHcy誘導的腎臟損傷

11、。
　　結論與創(chuàng)新性：
　　本研究首次發(fā)現，PGRN在hHcys模型腎臟中顯著降低，并且在GEnC和HPC中，PGRN呈現出Hcys劑量依賴性降低。PGRN缺失加重hHcys介導的腎小球損傷、炎癥應答、炎癥細胞浸潤、裂孔隔膜蛋白和緊密連接蛋白破壞，從而損傷腎小球濾過屏障及腎臟功能。
　　PGRN的保護作用可能依賴于對Wnt/β-catenin信號通路的抑制。本研究有助于進一步闡明高同型半胱氨酸血癥誘導腎損傷的病理生理學