蝴蝶蘭類原球莖農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系構(gòu)建.pdf

1、蝴蝶蘭(Phalaenopsis aphrodite)為蘭科蝴蝶蘭屬植物，其花色艷麗而豐富、形似蝴蝶而優(yōu)美，且花期長(zhǎng)3～4個(gè)月之久，極具觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)廣受大眾喜愛(ài)。
　　本試驗(yàn)前期以蝴蝶蘭組培苗葉片為誘導(dǎo)材料，構(gòu)建了一個(gè)較為穩(wěn)定的類原球莖誘導(dǎo)體系，為蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)提供了受體材料。后期以蝴蝶蘭類原球莖和組培苗葉片為受體材料，研究了侵染液濃度，侵染時(shí)間，侵染添加物質(zhì)等多種因素對(duì)蝴蝶蘭遺傳轉(zhuǎn)化的影響，探索最佳遺傳轉(zhuǎn)化

2、條件。并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將目的基因轉(zhuǎn)入了蝴蝶蘭受體材料，構(gòu)建了蝴蝶蘭類原球莖轉(zhuǎn)基因體系，為后續(xù)導(dǎo)入目的外源基因及基因功能驗(yàn)證等工作奠定基礎(chǔ)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)蝴蝶蘭類原球莖誘導(dǎo)體系的建立
　　最適葉片的選擇:生長(zhǎng)4～5周，大小為8～12mm×10～13mm（葉寬×葉長(zhǎng)）的蝴蝶蘭葉片是誘導(dǎo)PLB的較好選擇。葉基部的PLB誘導(dǎo)率、PLB數(shù)目、芽誘導(dǎo)率均最高，葉尖部和葉中部次之;故葉基部是誘導(dǎo)PLB的

3、較好選擇。按不同規(guī)格切割的葉片當(dāng)中，規(guī)格為10mm×3mm的葉片最多長(zhǎng)出PLB，PLB誘導(dǎo)率達(dá)52.78％;其次是10mm×5mm的葉片，PLB誘導(dǎo)率達(dá)22.22％。
　　蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)類原球莖最適培養(yǎng)基為:1/2MS+TDZ0.2mg/L+BA4mg/L+CW20％+PVP3g/L+sucrose15g/L，Phytagel3g/L，pH為5.5，其PLB誘導(dǎo)率達(dá)47.21％,每個(gè)葉片上誘導(dǎo)出PLB數(shù)目平均值為8.15個(gè)。結(jié)果表

4、明使用0～lmg/L的TDZ和0～4mg/L的BA對(duì)葉片誘導(dǎo)PLB都具有積極作用。
　　(2)類原球莖的增殖與分化
　　最適的類原球莖增殖培養(yǎng)基為:1/2MS+ZT3mg/L+adenine sulfate10mg/L+CW15％+peptone2g/L+sucrose15g/L+ACl g/L, Phytagel3g/L, pH為5.5。
　　最適的類原球莖分化培養(yǎng)基為:花寶+BA3mg/L+CW15％+sucros

5、e15g/L+PVP2g/L, Phytagel3g/L, pH為5.5。
　　(3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建
　　以蝴蝶蘭類原球莖為受體材料，采用植物表達(dá)載體為pCAMBIA1301（含gus報(bào)告基因和潮霉素抗性基因hpt），菌株為EHA105的根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功構(gòu)建蝴蝶蘭類原球莖轉(zhuǎn)基因體系。蝴蝶蘭類原球莖預(yù)培養(yǎng)2～3d，農(nóng)桿菌菌液OD為0.3，侵染時(shí)間為