苦參堿結構修飾物-19抗大鼠實驗性肝纖維化作用及機制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是指在各種致病因子如炎癥、損傷、藥物、遺傳因素等的作用下，活化的成纖維細胞或肌成纖維細胞（myofibroblasts, MFs）增多，細胞外基質（extracellular matrix, ECM）大量沉積的病理改變。它是繼發(fā)于各種形式慢性肝損傷之后組織修復過程中的代償反應，亦是慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經的病理過程。肝纖維化為一動態(tài)過程，屬可逆性病變，因此

2、，阻斷、抑制或逆轉肝纖維化是治療慢性肝病的一個重要目標。
　　 既往認為，肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是肌成纖維細胞（myofibroblasts）的最主要來源[1-3]。但是，晚近研究表明原位間質細胞、上皮細胞及內皮細胞[4,5]，尤其是膽管細胞和肝細胞也被證明可通過上皮細胞間質轉型（epithelial-to-mesenchymaltransition, EMT）向肌成纖維細胞轉化[6,7

3、]，表明肝實質的上皮細胞也參與肝纖維化進程。
　　 苦參堿是從中國傳統(tǒng)中藥苦參中提取的一種生物堿，目前的研究發(fā)現其抗炎，免疫調節(jié)，對小鼠急性肝損傷具有保護作用,并能抗大鼠實驗性肝纖維化作用。雖然苦參堿的藥理作用廣泛，但是活性不高，需要對其進行結構改造，得到活性更強、毒性更低的衍生物。再者，苦參堿的藥理作用機制不明確，特別是其靶標蛋白的研究仍是空白。
　　 本課題組前期研究發(fā)現，苦參堿的羰基氧原子被硫原子取代后，其藥理活性

4、大為增強，為此我們對苦參堿進行結構改造，得到40多個苦參堿衍生物。本研究首先對部分苦參堿衍生物進行抗RAW264.7細胞釋放TNF-α作用和抑制NF-кB 轉錄活性的篩選，挑選出藥效高，毒性低的苦參堿衍生物-19（M-19）；接著對M-19 治療BDL和DMN 誘導的大鼠實驗性肝纖維化效果進行評價，并初步探討M-19 阻遏EMT 進程是其抗肝纖維化的作用機制之一；對M-19 抑制TGF-β1誘導原代培養(yǎng)肝細胞、原代培養(yǎng)肝星狀細胞和肝星狀

5、細胞系HSC-T6細胞EMT 進程的阻斷，以及對HSC-T6細胞增殖抑制、凋亡誘導作用的研究，闡釋M-19抗肝纖維化的多環(huán)節(jié)機制；通過連續(xù)親和色譜法、競爭親和色譜法結合MALDI-TOF-TOF 質譜鑒定等技術，確證Mat及M-19的特異結合蛋白為核糖體蛋白S5(RPS5)。通過免疫組化和Real-time PCR 檢測RPS5在纖維化模型大鼠組織中表達變化，以及RPS5在原代肝星狀細胞和HSC-T6細胞EMT中的作用研究，推測Mat及

6、M-19 可能通過抑制肝臟細胞RPS5的降解或表達水平的下降，而發(fā)揮抗肝纖維化作用。
　　 實驗方法：
　　 一、苦參堿衍生物抗RAW264.7細胞釋放TNF-α和抑制NF-кB 轉錄活性篩選
　　 （一）采用MTT 法測定不同濃度的苦參堿及苦參堿衍生物處理24h，對RAW264.7細胞增殖活性的影響，以比較藥物的細胞毒性作用，并確定安全的藥理作用濃度范圍。
　　 （二）分別采用細胞毒結晶紫法和ELISA

7、 法對LPS 刺激的RAW264.7細胞上清中的TNF-α生物學活性和含量進行測定，比較苦參堿和一系列苦參堿衍生物對RAW264.7細胞釋放TNF-α的抑制作用，篩選出高活性衍生物。
　　 （三）采用雙熒光素酶報告基因法，測定苦參堿衍生物對LPS 刺激的RAW264.7細胞NF-кB 轉錄活性的抑制作用，進一步比較藥物的藥理活性。
　　 二、苦參堿及苦參堿衍生物-19抗大鼠實驗性肝纖維化作用研究
　　 （一）苦參

8、堿及苦參堿衍生物-19對BDL大鼠肝纖維化的抑制作用將雄性SD大鼠隨機分為7組，假手術組6只，其余各組10只，分設假手術組、膽總管結扎組、苦參堿衍生物-19：12.5mg/kg、 25mg/kg和50mg/kg 治療組，苦參堿50mg/kg 治療組,氧化苦參堿50mg/kg 治療組。鈍性分離并結扎膽總管，制備BDL 肝纖維化模型。術后3d，各藥物組灌胃給予相應藥物處理，假手術組和膽總管接扎組灌胃生理鹽水。于接扎后第25d 處死大鼠，堿水

9、解法測定各組肝組織羥脯氨酸含量；HE 染色觀察纖維化程度，Masson和Sirius red 染色以計算ECM 含量。Realtime RT-PCR及免疫組織化學法測定肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α－平滑肌激動蛋白（α-SMA）、鈣粘附蛋白（E-cadherin）、HNF4α和TGF-β1等EMT 相關基因的表達。
　　 （二）苦參堿及苦參堿衍生物-19對DMN 損傷大鼠肝纖維化的抑制作用將雄性SD大鼠隨機分為7組，對照組7只，其

10、余各組每組10只，分設假手術組、膽總管結扎組、苦參堿衍生物-19：12.5mg/kg、 25mg/kg和50mg/kg 治療組，苦參堿50mg/kg 治療組,氧化苦參堿50mg/kg 治療組。除空白對照組外，其余各組予1％DMN溶液按照10μg/kg的劑量腹腔注射，每周連續(xù)注射3次，共注射5w，制備DMN 誘導的大鼠肝纖維化模型。于DMN 注射第5w 起各組灌胃給予相應藥物治療，空白對照組和模型對照組灌胃生理鹽水處理。藥物治療3w后處死

11、，觀察指標同BDL模型。
　　 三、M-19 體外抗肝纖維化作用機制研究
　　 （一）M-19對原代肝細胞EMT 抑制作用研究分離制備原代培養(yǎng)SD大鼠肝細胞，培養(yǎng)2 d后，換成含有2ng/ml TGF-β1無血清培養(yǎng)基，同時設立空白對照組和M-19：5，10,20umol/L 處理組。刺激48h后，提取細胞總RNA。ReAltime RT-PCR 法檢測肝細胞核因子4α（HNF4α）、上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadheri

12、n）等基因mRNA水平。
　　 （二）M-19對原代肝星狀細胞EMT 抑制作用研究分離制備原代培養(yǎng)SD大鼠肝細胞，培養(yǎng)2 d后，換成含有2ng/ml TGF-β1無血清培養(yǎng)基，同時設立空白對照組和M-19：5，10,20umol/L 處理組。刺激24h后，提取細胞總RNA。ReAltime RT-PCR 法檢測α-SMA、Vimentin和Collagen I等基因mRNA水平。
　　 （三）M-19對肝星狀細胞系HSC

13、-T6 EMT 抑制作用研究HSC-T6細胞1.5×105/well分于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，加入2ng/ml TGF-β1刺激24h，同時設立空白對照組、苦參堿衍生物-19：2.5，5，,10umol/L 處理組。收集細胞，提取總RNA，ReAltime RT-PCR 檢測E-cadherin、α-SMA、CollagenI和CollagenIII基因的mRNA水平（四）M-19對肝星狀細胞系HSC-T6 增殖抑制作用研究HS

14、C-T6細胞1.5×104/well分于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，加入終濃度為0.8，4， 10, 20, 40, 100umol/L M-19，繼續(xù)處理24h 或48h。MTT 法測定細胞的增殖活性（五）M-19 誘導肝星狀細胞系HSC-T6 凋亡作用研究HSC-T6細胞1.5×104/well分于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，加入終濃度為10，20，40umol/L的M-19，繼續(xù)處理24h，收集細胞，流式細胞術檢測凋亡率四、

15、MAT和M-19 特異結合蛋白的研究。
　　 結論：
　　 一、M-19和M-24對RAW264.7細胞的增殖活性抑制作用較小，對LPS 刺激RAW細胞釋放TNF-α抑制作用好于苦參堿及同類苦參堿衍生物，并具有抑制NF-кB 轉錄活性作用。
　　 二、M-19 可抑制BDL 或DMN 肝纖維化大鼠肝組織EMT 進程，降低肝臟ECM沉積，具有抗肝纖維化作用。
　　 三、M-19抗肝纖維化作用機制與其抑制肝細