人脂肪基質(zhì)細胞的培養(yǎng)及誘導分化為神經(jīng)元樣細胞的研究.pdf

1、目的：1．建立人脂肪基質(zhì)細胞(Human adipose-derived stromal cells，hADSCs)的體外培養(yǎng)方法，觀察其體外增殖能力及生物學特性，對干細胞表面相關(guān)標志進行檢測鑒定。2．誘導hADSCs向脂肪細胞、神經(jīng)細胞定向分化，摸索向神經(jīng)細胞分化的誘導條件，并初步探討其向神經(jīng)細胞分化的機制，為ADSCs作為神經(jīng)系統(tǒng)的移植細胞提供理論依據(jù)。 方法：1．細胞分離與培養(yǎng)：收集手術(shù)中廢棄的脂肪組織，Hank's液反復沖

2、洗血污，去除肉眼可見小血管和纖維，機械切割后以Ⅰ型膠原酶37℃振蕩消化60min，經(jīng)篩網(wǎng)過濾后1000r/min離心10分鐘，棄上清，所獲沉淀靜置于紅細胞裂解液中10min以溶解紅細胞，通過反復離心洗滌去除裂解液并獲得細胞沉淀，按2×104個/mL，的細胞濃度接種在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。24h后去除懸浮細胞，換新鮮培養(yǎng)基，2～3d換液一次。每日倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及增殖特征，用

3、細胞記數(shù)法測定ADSCs生長曲線，計算細胞群體倍增時間。細胞生長至70％時融合時傳代，用0.25％的胰蛋白酶/EDTA消化細胞。鏡下觀察，細胞收縮變圓即用含血清的培養(yǎng)基終止消化。單個細胞懸液按2×104個/mL密度接種于培養(yǎng)瓶或孔板。對傳代細胞進行HE染色，利用免疫細胞化學技術(shù)，鑒定間充質(zhì)干細胞表面分子CD44和間充質(zhì)來源標志波形蛋白。第三代hADSCs凍存，一個月后復蘇細胞，觀察復蘇后細胞的生長情況。2．細胞的誘導分化①向脂肪細胞分化

4、：傳代細胞在無血清、非融合狀態(tài)的初始條件下，實驗組以地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌吟、胰島素作為復合誘導劑，體外誘導人脂肪基質(zhì)細胞向脂肪細胞分化；對照組不加誘導劑。觀察分化過程中細胞形態(tài)變化，油紅O染色鑒定，計算細胞分化率。②向神經(jīng)細胞分化：脂肪基質(zhì)細胞接種于預置玻片的24孔板中，待細胞貼壁后，棄原有血清。實驗組細胞用含β-巰基乙醇 (β-mercaptoethano，β-BME)的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基預誘導24h后，換用含

5、丁酸羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)和二甲基亞砜 (dimathyl sulfoxide，DMSO)的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基正式誘導；對照組細胞不加任何誘導劑。誘導過程中實時監(jiān)測細胞形態(tài)學變化。在6h、12h、24h、48h取出細胞爬片，應用免疫細胞化學法檢測神經(jīng)元特異性標記物——神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase， NSE)。 結(jié)果：人脂肪組織中分離

6、培養(yǎng)出脂肪基質(zhì)細胞，形態(tài)類似成纖維細胞，具有良好的體外增殖能力，經(jīng)冷凍保存，復蘇后仍能較好生長。細胞生長曲線分析：細胞體外傳代培養(yǎng)細胞的潛伏期約為24～48h，對數(shù)增生期為7d左右，接種10d后進入平臺期，倍增時間為62.38h。原代培養(yǎng)的部分細胞能自發(fā)向脂肪細胞分化，而傳代細胞始終保持梭形不能自發(fā)向脂肪細胞分化。培養(yǎng)細胞HE染色顯示，細胞呈梭形，胞質(zhì)豐富，弱嗜堿性染成淡藍色；免疫組化陽性反應為胞質(zhì)被染為棕黃色，波形蛋白陽性率(97.1

7、±2.3)％，說明細胞來源于間充質(zhì)，無其它胚層細胞污染；間充質(zhì)干細胞表面抗原CD44陽性率為(85.4±3.22)％。向脂肪細胞誘導第7d，細胞變圓，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量小液滴，折光性強；隨著液滴增加，誘導8～14d，小液滴繼續(xù)增多、融合，聚集為房性液滴，且大小不等多散在，被油紅O染為紅色，證明為脂滴，提示細胞向脂肪細胞方向分化；誘導三周后，細胞內(nèi)充滿脂滴，分化形態(tài)趨于完全。實驗組分化細胞陽性率為(78.6±2.2)％；對照組沒有或只有少量油

8、紅O陽性細胞。分化成熟的脂肪細胞很容易脫離瓶底，漂浮在培養(yǎng)液中。3.向神經(jīng)細胞誘導分化的過程中：預誘導24h后，少量細胞寬大扁平的胞質(zhì)開始向核收縮。正式誘導2h后，部分細胞胞體收縮，折光性增強，伸出短小的突起；6h后，細胞形態(tài)呈神經(jīng)元樣改變，從簡單的雙極細胞到復雜的多極細胞均有出現(xiàn)，NSE陽性率為(37.01±3.12)％。12h后，神經(jīng)元樣細胞數(shù)量增多，并可見部分細胞突起相連拉成網(wǎng)狀；此時NSE陽性率最高達到(63.71±3.5)％；

9、24h后，神經(jīng)元樣細胞數(shù)量未明顯增加，且出現(xiàn)衰老現(xiàn)象；NSE陽性率降至(40.21±3.32)％。誘導48h后，幾乎所有神經(jīng)元樣細胞逐漸脫落死亡；NSE陽性率降至最低，為(15.33±2.61)％。實驗組相鄰時間點NSE陽性率比較，差異有顯著意義(P<0.05)。對照組細胞一直保持寬大扁平的狀態(tài)，有少量NSE弱陽性細胞，NSE陽性率在不同時間點均為3.8％左右，與實驗組同一時間點NSE陽性率比較，有顯著性差異(P<0.05)。