小鼠肝臟中CK19陽性細胞分化特性的研究.pdf

1、目前，對于肝臟中具有干性的細胞（如肝前體細胞）已有不少的研究，但對于肝臟中真正的肝干細胞則缺乏認識。一般認為，這主要與有效研究體系的缺乏有關(guān)。在該研究領(lǐng)域中，不同實驗室所報道的肝干性細胞的表型和分子特征存在著很大的差異，但他們所報道的這些干性細胞都有一個共同的特征，即都表達CK19?；谶@一現(xiàn)象，結(jié)合本人所在實驗室前期關(guān)于肝前體細胞研究的發(fā)現(xiàn)，本人提出了“肝臟中的CK19+細胞譜系中可能包含有真正的肝干細胞(authentic live

2、r stem cell)”的科學假設。
　　本研究采用Cre/loxP體系對CK19+細胞譜系示蹤，并結(jié)合在肝細胞損傷和膽管損傷模型中對CK19+細胞分化特性的研究，對“肝臟中的CK19+細胞譜系中可能含有真正的肝干細胞”這一假設進行了驗證。在該研究中，首先將C57BL/6品系的CK19CreERT小鼠與Rsoa26-GFP小鼠進行雜交，獲得了CK19CreERT/ Rosa26-GFP雙陽性小鼠。在此基礎上，通過他莫昔芬(tam

3、oxifen，TM)的應用，實現(xiàn)了肝臟中CK19+細胞的穩(wěn)定性遺傳標記（即標記上GFP），進而，采用肝組織冰凍切片直接熒光顯微鏡觀察和免疫熒光分析，明確了這種標記細胞在肝臟中的空間定位為門管區(qū)。隨后，利用這種CK19+細胞已被遺傳標記的CK19CreERT/Rosa26-GFP小鼠制備了兩種肝臟損傷模型——DDC肝損傷模型和CCl4肝損傷模型，以用于被標記的CK19+細胞是否具有肝向分化和膽向分化潛能的探討。在DDC損傷的小鼠模型中，可

4、以發(fā)生膽管損傷，并可出現(xiàn)損傷修復，表現(xiàn)為膽管反應的發(fā)生。這種損傷模型，可用于研究被標記的CK19+細胞是否具有分化為膽管上皮細胞的特性。在CCl4損傷的小鼠模型中，可以發(fā)生肝細胞的損傷，并可出現(xiàn)肝細胞的修復。這種損傷模型，可用于研究被標記的CK19+細胞是否具有分化為成熟肝細胞的特性。本研究成功構(gòu)建了基于CK19CreERT/Rosa26-GFP小鼠的DDC肝損傷模型和CCl4肝損傷模型，并在此基礎上，分別對兩種肝損傷模型小鼠肝組織進行

5、冰凍切片和免疫熒光檢測。在DDC損傷模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，增生性小膽管中有GFP+細胞的出現(xiàn)，并通過免疫熒光檢測證實了這些GFP+細胞也表達CK19（膽管上皮細胞標志物），說明存在于這些增殖性膽管中的CK19+細胞來源于譜系示蹤標記的GFP+細胞，也提示了譜系示蹤標記的GFP+細胞譜系中有具有膽向分化潛能的細胞類型的存在;在CCl4損傷模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，肝小葉中有GFP+細胞的出現(xiàn)，并通過免疫熒光檢測證實了這些GFP+細胞也表達ALB（成熟肝細