力學拉伸應變對成骨細胞的影響及其作用機制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 骨是由細胞、細胞外基質(zhì)和無機物組成的特殊結(jié)締組織，是人體承擔力學載荷的主要器官，并通過骨組織細胞進行骨塑建和重建。骨重建不僅受到遺傳、激素、新陳代謝、年齡等生物學因素的影響，而且還依賴于其所處的力學環(huán)境。由Wolff定律可知，力學載荷缺失導致骨量減少，而適度的力學刺激能夠促進骨形成。成骨細胞來源于間充質(zhì)干細胞，是骨生長、重建和修復的關鍵細胞。成骨細胞以及它的前體細胞對周圍生物力學環(huán)境的變化非常敏感，可以將

2、感受到的力學信號轉(zhuǎn)變?yōu)樯飳W信號進而調(diào)節(jié)骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。體內(nèi)骨組織所處的力學環(huán)境非常復雜，附著于骨基質(zhì)上的成骨細胞會受到多種生物學因素的干擾，因此，體內(nèi)實驗很難準確反映力學刺激對成骨細胞的影響。對體外培養(yǎng)的成骨細胞進行離體力學加載實驗可以有效排除體內(nèi)實驗中各種因素的干擾。此外，還可以設計力的加載方式、大小、頻率以及作用時間等力學參數(shù)準確檢測力學刺激對成骨細胞的影響。成骨細胞是骨對力學信號進行響應的效應細胞，但力學刺激對成骨細胞的影響以及成

3、骨細胞的力學信號響應機制仍不明確。本研究擬通過四點彎曲力學加載裝置對培養(yǎng)的成骨細胞系MC3T3-E1細胞進行不同強度和不同時間的力學拉伸，研究力學信號對成骨細胞增殖、凋亡、分化和礦化的影響，并深入探討成骨細胞的力學信號響應機制，為進一步研究力學條件下骨發(fā)生、重建的生物學機制提供理論依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.應用四點彎曲力學加載裝置對小鼠成骨細胞系MC3T3-E1細胞施加頻率為0.5 Hz，不同強度(500με、

4、1000με、2000με、3000με、5000με)的力學拉伸應變，力學拉伸結(jié)束后采用MTT實驗檢測細胞增殖情況、DNA ladder和流式細胞術檢測細胞凋亡情況、RT-PCR和Western Blot檢測細胞分化標志基因表達情況、Von Kossa染色檢測細胞礦化情況。
　　 2.給MC3T3-E1細胞施加強度為2000με，頻率為0.5 HZ不同時間(2h、4h、8h、12h、24h)的力學拉伸應變，拉伸結(jié)束后對成骨細胞

5、的增殖、凋亡、分化和礦化情況進行檢測。
　　 3.采用RT-PCR和Western Blot方法檢測力學拉伸應變對BMPs/Smad信號通路中各個分子表達的影響；采用ELISA方法檢測力學拉伸后成骨細胞培養(yǎng)基中BMP-2和BMP-4的含量；采用Western Blot方法檢測力學拉伸應變對Smad蛋白的活化以及p-Smad向細胞核轉(zhuǎn)移的影響。
　　 4.力學拉伸前2h以Noggin預處理MC3T3-E1細胞，然后進行8h

6、的力學拉伸，檢測阻斷BMPs通路對力學拉伸過程中Smad蛋白的活化以及成骨細胞分化標志基因表達的影響；力學拉伸前轉(zhuǎn)染Smad4 siRNA抑制Smad4的表達，然后進行8h的力學拉伸，檢測力學拉伸后p-Smad的細胞核轉(zhuǎn)移情況以及成骨細胞分化標志基因的表達情況。
　　 5.采用Western Blot方法檢測力學拉伸后p38MAPK和NF-κB通路的活化情況；力學拉伸前以PDTC預處理MC3T3-E1細胞，檢測阻斷NF-κB通路

7、對力學拉伸過程中BMPs表達的影響；力學拉伸前以Noggin預處理MC3T3-E1細胞，檢測力學拉伸過程中p38MAPK的激活與BMPs信號的關系；力學拉伸前以SB203580預處理MC3T3-E1細胞，檢測阻斷p38MAPK通路對力學拉伸過程中NF-κB通路的激活、BMPs的表達以及成骨細胞分化標志基因表達的影響。
　　 6.采用RT-PCR和Western Blot方法檢測力學拉伸應變對Smurf1、Smurf2和CKIP-

8、1表達的影響。
　　 7.力學拉伸前轉(zhuǎn)染Smurf1 siRNA，然后進行8h的力學拉伸，檢測抑制Smurf1的表達對力學拉伸過程中Smad、p-Smad以及成骨細胞分化相關基因表達的影響；力學拉伸前以MG132預處理MC3T3-E1細胞，檢測抑制蛋白酶體活性對力學拉伸過程中Smad和p-Smad的含量以及成骨細胞分化相關基因表達的影響。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.1000με、2000με和3000με的力學

9、拉伸強度能促進成骨細胞分化標志基因的表達，其中2000με的作用最明顯，但各個力學拉伸強度均未影響成骨細胞的增殖、凋亡和礦化。
　　 2.2000με應變強度下，不同時間的力學拉伸對成骨細胞增殖、凋亡和礦化沒有明顯作用。力學拉伸過程中成骨細胞分化標志基因表達的上調(diào)有一定的時間依賴性：ALP的表達在力學拉伸4h時開始顯著升高，8h時表達最強，24h后恢復正常水平；OCN的表達在力學拉伸8h時開始顯著升高，并持續(xù)高表達至24h；而C

10、ol I的表達在力學拉伸4h時開始顯著上調(diào)，24h時表達水平仍高于對照組。
　　 3.力學拉伸應變能夠促進BMP-2和BMP-4的表達和分泌。BMPR I、Smad1和Smad5 mRNA表達水平?jīng)]有明顯變化，但它們的蛋白水平在力學拉伸后升高。Smad1和Smad5在力學拉伸過程中被激活，且激活的Smad(p-Smad)在細胞核內(nèi)的含量升高。
　　 4.Noggin抑制了力學拉伸過程中Smad蛋白的活化，Smad4 si

11、RNA抑制了力學拉伸過程中p-Smad向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。Noggin和Smad4 siRNA均能抑制力學拉伸過程中成骨細胞分化標志基因的表達。
　　 5.p38MAPK通路在力學拉伸15min被激活，NF-κB通路在力學拉伸30min被激活，它們均在力學拉伸90min后失活；PDTC阻斷NF-κB通路抑制了力學拉伸過程中BMP-2和BMP-4的表達；Noggin阻斷BMPs信號并未抑制力學拉伸過程中p38 MAPK通路的激活，表

12、明力學拉伸過程中p38 MAPK的激活不依賴于BMPs信號；SB203580阻斷p38 MAPK通路抑制了力學拉伸過程中NF-κB通路的活化、BMPs和成骨細胞分化相關基因的表達，表明力學拉伸過程中NF-κB通路的活化以及BMPs的表達依賴于p38MAPK通路。
　　 6.力學拉伸應變對Smurf2和CKIP-1的表達沒有明顯作用，但下調(diào)了Smurf1的表達。
　　 7.轉(zhuǎn)染Smurf1 siRNA和MG132預處理MC

13、3T3-E1細胞進一步上調(diào)了力學拉伸過程中BMPR I和Smad蛋白的含量、Smad蛋白的激活以及成骨細胞分化相關基因的表達。
　　 結(jié)論：
　　 1.力學拉伸應變促進了成骨細胞的分化。
　　 2.BMPs/Smad信號通路在力學拉伸過程中被激活，力學信號通過BMPs/Smad通路促進成骨細胞分化標志基因的表達。
　　 3.p38 MAPK通路和NF-κB通路在成骨細胞力學拉伸過程中存在偶聯(lián)，力學信號通過

14、p38 MAPKfNF-κB通路上調(diào)BMPs的表達，并進一步激活BMPs/Smad通路誘導成骨細胞分化標志基因的表達。
　　 4.力學拉伸下調(diào)了Smurf1的表達并進一步抑制了Smurf1介導的BMPR I和Smad蛋白的降解，Smurf1表達的下調(diào)促進了力學拉伸過程中BMPs/Smad通路的活化。
　　 綜上所述，力學信號通過激活p38MAPK/NF-κB通路和下調(diào)Smurf1的表達促進BMPs/Smad通路在力學拉伸