Intermedin對(duì)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞增殖、凋亡、分化及RANKL-OPG-M-CSF表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　骨重建是人體健康骨組織的重要生理程序，它由骨形成和骨吸收共同完成。骨形成主要通過(guò)成骨細(xì)胞的增殖、分化來(lái)實(shí)現(xiàn)，而骨吸收則是由破骨細(xì)胞來(lái)完成，二者相互影響，維持一種平衡的生理狀態(tài)。當(dāng)這種平衡被破壞以后會(huì)導(dǎo)致多種病理情況，其中就包括骨質(zhì)疏松。
　　現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)的降鈣素基因相關(guān)肽超家族包括7個(gè)成員:降鈣素(Calcitonin，CT)胰淀粉酶(Amylin)，兩種降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)，腎上腺髓質(zhì)素(Adrenom

2、edullin，AMD)，降鈣素受體刺激肽(calcitonin receptor-stimulating peptide，CRSP)以及垂體中介素(Intermedin，IMD)。Intermedin(IMD)是最近發(fā)現(xiàn)的降鈣素基因相關(guān)肽家族的新成員，它在人體很多組織都有表達(dá)，比如:胃腸道、肺、下丘腦、腎上腺及心臟等組織器官。與其他降鈣素基因家族相關(guān)肽成員相似，IMD通過(guò)與降鈣素樣受體CRLR結(jié)合激活受體活化蛋白R(shí)AMP1/RAMP2

3、/RAMP3發(fā)揮生物學(xué)效用。它對(duì)骨吸收的作用與降鈣素(CT)和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的作用相似，都可以抑制骨吸收，但是它的作用機(jī)制還沒(méi)有被完全研究透徹。
　　本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的IMD(0、1、10和100nM）干預(yù)小鼠MC3TC-E1成骨細(xì)胞，通過(guò)MTT、流式細(xì)胞儀、real time PCR和western blot等試驗(yàn)方法檢測(cè)IMD對(duì)MC3TC-E1細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及RANKL/OPG/M-CSF表達(dá)的影響，進(jìn)

4、一步完善IMD對(duì)骨重建的影響機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1、材料
　　(1)細(xì)胞系小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1(ATCC)。
　　(2)主要試劑 Intermedin/IMD（美國(guó)鳳凰制藥）、AnnexinⅤ-FITC/PI(BD)、MTT試劑盒(sigma)，Caspase-3活性試劑盒(Promega) OPG、RANKL、M-CSF和Caspase-3抗體(santa)，引物和PCR試劑盒(TaKaRa

5、)。
　　2、實(shí)驗(yàn)方法
　　(1)不同濃度IMD干預(yù)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞，應(yīng)用MTT方法檢測(cè)IMD對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響;
　　(2)無(wú)血清或者地塞米松誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡，同時(shí)加入不同濃度IMD干預(yù)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IMD對(duì)成骨細(xì)胞凋亡;
　　(3)不同濃度IMD干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞，應(yīng)用Real time PCR技術(shù)檢測(cè)OCN，BSP及RANKL/OPG/M-CSF nRNA的表達(dá);
　

6、　(4)不同濃度IMD干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)Caspase-3，RANKL/OPG/M-CSF蛋白的表達(dá);
　　(5)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞系;
　　(6)成骨誘導(dǎo)分化，同時(shí)加入不同濃度的IMD干預(yù)，應(yīng)用茜素紅染色和ALP活性測(cè)定檢測(cè)成骨細(xì)胞分化。
　　3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，采用t檢驗(yàn)和單因素

7、方差分析的統(tǒng)計(jì)方法，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)胞增殖不同濃度IMD干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增值率，結(jié)果顯示不同濃度IMD組與空白對(duì)照組的增值率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、細(xì)胞分化不同濃度IMD干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞后，結(jié)果顯示不同濃度IMD組與空白對(duì)照組的ALP活性、OCN/BSP mRNA表達(dá)和茜素紅染色均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、細(xì)胞凋亡不同濃度IMD干預(yù)無(wú)

8、血清或者10-7M地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，100nM IMD組較無(wú)血清組或10-7 M地塞米松組的annexinⅤ/PI染色率和Caspase-3活性顯著降低(p＜0.01)。
　　4、RANKL/OPG/M-CSF不同濃度IMD干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞后，100nM IMD組的RANKL及M-CSF表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，OPG的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、IMD對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的