MicroRNA-34a對Delta-like1的調控及其對乳腺癌干細胞的影響.pdf

1、背景:
　　乳腺癌作為女性惡性腫瘤中最常見的也是最具威脅力的惡性腫瘤，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)顯示其全球發(fā)病率僅次于第一位的肺癌。隨著研究的深入，其治療方式越來越趨于多樣化，常見的有手術治療、放疔、化療、內分泌治療、中醫(yī)針灸等。然而臨床上仍然有1/3的女性經(jīng)過治療后發(fā)生復發(fā)和轉移。研究人員指出，許多涉及調控腫瘤發(fā)生發(fā)展轉歸的基因與蛋白都參與了對腫瘤干細胞調控。其中，miR-34a是與乳腺癌密切相關的小分子RNA之一，它在乳腺癌的增殖、侵襲、轉

2、移及凋亡等過程中均發(fā)揮了重要作用。MicroRNA-34a作為抑癌基因p53下游靶基因，它介導的細胞凋亡在腫瘤干細胞的自我更新中可能發(fā)揮重要作用，只有殺滅乳腺癌干細胞才能進一步改善乳腺癌患者的預后。
　　DLL1(Delta-like1)蛋白作為Notch信號轉導通路中Notch1受體的配體，是單次跨膜糖蛋白，屬于DSL（Delta，Serrate，Lag-2）蛋白。Notch信號轉導途徑的活化最早始于Notch配體結合到Notc

3、h受體，二者結合后經(jīng)過一系列生化反應活化Notch信號轉導通路，各種不同組織及其細胞的正常的或異常的生長發(fā)育分化活動都要受到該通路的調控。另有研究指出DLL1參與調控腫瘤的增殖、分化、凋亡、轉移、復發(fā)等過程。Notch信號轉導通路作用非常廣泛，它不僅對胚胎及正常組織的生長發(fā)育至關重要，還是腫瘤干細胞中必不可少的信號轉導通路之一。新近研究表明:Notch信號的表達增強增加了腫瘤細胞的增殖能力，活化Notch信號可以起到維持腫瘤干細胞，誘導

4、上皮間質轉化等作用。Notch信號轉導通路的下游靶基因在該通路生物學特性的實現(xiàn)過程中扮演著重要角色，其中已知的靶基因包括:Hey、cyclin D1、Hes、NRARP、p21、pre-Tα、NF-κ B等。
　　目的:
　　探討MiR-34a對DLL1蛋白的調控作用，以及MiR-34a/DLL1與Notch信號通路和乳腺癌干細胞的作用，為乳腺癌的診斷和治療提供重要的理論和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.將乳腺癌

5、細胞株MCF-7作為主要研究對象，采用免疫磁珠分選技術分選CD44+/CD24-乳腺癌干細胞，qRT-PCR，Western Blot技術檢測分選出的干細胞中MiR-34a和DLL1蛋白表達趨勢。
　　2.轉染miR-34a類似物和阻滯劑調節(jié)DLL1蛋白在MCF-7細胞株中的表達情況。qRT-PCR和Western Blot技術分別檢測MCF-7細胞內DLL1 mRNA和DLL1蛋白的表達趨勢，Western Blot進一步探索N

6、otch信號轉導通路下游靶基因HEY1蛋白的表達、乳腺癌干細胞重要標記物ALDH1表達以及凋亡相關的Caspase3蛋白的表達情況，探討miR-34a/DLL1蛋白對腫瘤及干細胞凋亡的影響及其機制。
　　3.小RNA分子干擾技術構造DLL1基因沉默的乳腺癌細胞系模型，通過qRT-PCR和Western Blot技術相繼檢測轉染后的沉默效率，確定DLL1基因被成功下調，Western Blot技術檢測HEY1，Caspase3及AL

7、DH1蛋白的表達，進一步證明miR-34a通過調控DLL1蛋白實現(xiàn)其對Notch信號轉導通路及乳腺癌干細胞的調控。
　　4.最后采用CCK-8實驗和Hochest33342染色驗證miR-34a/DLL1對乳腺癌細胞的增殖和凋亡的影響。
　　結果:
　　1.分選CD44+/CD24-乳腺癌干細胞后，檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細胞中的miR-34a趨于低表達狀態(tài)，而DLL1蛋白則趨于高表達。
　　2.通過轉染實驗過表達/抑制

8、miR-34a后，Western Blot，qRT-PCR分別檢測DLL1蛋白表達水以及基因表達水平;Western Blot檢測HEY1，Caspase3，ALDH1蛋白表達，結果顯示過表達miR-34a從轉錄水平抑制了DLL1蛋白表達，HEY1蛋白、ALDH1與DLL1蛋白表達水平正相關，而Caspase3表達水平與DLL1蛋白負相關。
　　3.小RNA干擾技術敲低DLL1基因表達后，Western Blot方法檢測HEY1，

9、Caspase3，ALDH1蛋白表達與miR-34a mimics轉染后的表達水平一致。
　　4.CCK-8法檢測DLL1蛋白對乳腺癌細胞增殖的影響結果顯示:與對照組相比，下調DLL1蛋白抑制了MCF-7細胞增殖，上調DLL1蛋白對細胞增殖有促進作用。Hochest33342染色結果表明下調DLL1蛋白后凋亡的細胞數(shù)增多。下調DLL1蛋白對細胞增殖的抑制作用可能是由于其誘導凋亡作用減少所致。
　　結論:
　　1.MiR