YC-1玻璃體腔注射治療獼猴視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞（central retinal vein occlusion, CRVO）是僅次于糖尿病視網(wǎng)膜病變的血管性疾病，患病率在0.7-1.6％之間，常常引起嚴(yán)重的視力下降甚至致盲。盡管確切的機(jī)制不清，但由于血管通透性增加導(dǎo)致的視網(wǎng)膜廣泛出血及黃斑水腫（cystoids macular edema, CME）是主要的原因之一。目前，已有足夠的證據(jù)表明 VEGF在視網(wǎng)膜血管性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用。分子水平上，VEG

2、F通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、移行以及增加血管內(nèi)皮的通透性發(fā)揮病理作用。臨床研究證明玻璃體腔注射抗VEGF藥物，通過抑制VEGF與其受體相結(jié)合，從而抑制脈絡(luò)膜，視網(wǎng)膜新生血管生長及血管滲漏，可以明顯改善 CRVO引起的黃斑水腫，不同程度改善患者視力。在包括老年性黃斑變性（AMD），視網(wǎng)膜靜脈阻塞（RVO）及糖尿病視網(wǎng)膜病變（RD）的治療中，抗 VEGF藥物的玻璃體腔注射治療已成為一線的治療方案。然而，隨著抗 VEGF藥物的廣泛應(yīng)用，仍有

3、諸多問題有待解決:由于藥物半衰期短，需要頻繁行眼內(nèi)注藥治療以穩(wěn)定視力，增加了發(fā)生眼內(nèi)炎的潛在風(fēng)險(xiǎn)；部分難治性CRVO患者經(jīng)治療后，視力及黃斑水腫并沒有改善甚至惡化，即所謂“反彈”效應(yīng)；長期使用出現(xiàn)了色素上皮細(xì)胞及感光細(xì)胞層的萎縮現(xiàn)象。另一方面，炎癥因子可能也發(fā)揮了一定的作用，臨床研究證實(shí):多種炎癥因子如：IL1β，IL6, IL8，IL10，IL12，IL13，單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1），可溶性細(xì)胞黏附因子1（SiCAM-1）,干

4、擾素等在 CRVO患者的玻璃體和房水中明顯升高。通過玻璃體腔注射曲安奈德，有效抑制了 VEGF和炎癥因子的升高，減輕 CRVO患者黃斑水腫，提高視力。然而，激素的嚴(yán)重副作用限制了它的廣泛應(yīng)用，研究表明經(jīng)過曲安奈德玻璃體腔注射后，48-67%的患者出現(xiàn)不同程度的白內(nèi)障，40%有眼內(nèi)壓升高的表現(xiàn)，0.1%的眼內(nèi)炎風(fēng)險(xiǎn)。因此尋找新的靶向藥物勢(shì)在必行。
　　在視網(wǎng)膜血管疾病的病理過程中，缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）起到了非常重要的作用，根

5、據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，包括VEGF, EPO在內(nèi)的多種血管相關(guān)因子受到 HIF-1二聚體的調(diào)控。YC-1作為 HIF-1α的抑制劑，通過抑制 HIF-1復(fù)合體的產(chǎn)生，在轉(zhuǎn)錄水平提前遏制VEGF等多種血管相關(guān)因子的產(chǎn)生，同時(shí)YC-1通過調(diào)控NF-KB通道（目前認(rèn)為該通道是主要的炎癥因子調(diào)控通道）間接抑制炎癥因子的產(chǎn)生。因此YC-1兼具抗VEGF及抗炎的雙重作用，極具研究?jī)r(jià)值。獼猴具有與人類類似的黃斑結(jié)構(gòu)，通過激光建立CRVO獼猴動(dòng)物模型后，經(jīng)玻璃體

6、腔注射YC-1，可以觀察眼球組織結(jié)構(gòu)，特別是黃斑結(jié)構(gòu)的變化，以及玻璃體和視網(wǎng)膜中分子水平的變化，探討YC-1玻璃體腔注射治療CRVO疾病的可行性。
　　第一部分 YC-1藥物在正常獼猴玻璃體腔中的藥物動(dòng)力學(xué)研究
　　目的：在成年獼猴玻璃體腔中注射YC-1藥物，觀察其藥物動(dòng)力學(xué)變化，為進(jìn)一步應(yīng)用提供初步研究數(shù)據(jù)。
　　方法：選取正常獼猴3只，共6只眼睛，應(yīng)用YC-1；化學(xué)名稱為3-(5-hydroxymethyl-2-f

7、uryl)-1-benzyl indazole(中文名稱：3-(5-羥甲基-2-呋喃基)-1-苯甲基吲唑)(intel number.815605mg Cayman Chemical)；溶解在DMSO(二甲基氬砜，濃度為0.01%)藥物中，稀釋成200μM濃度后，抽取90μl注入獼猴玻璃體腔中，并分別在注射后0.25小時(shí)，0.5小時(shí)，1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)，4小時(shí)，5小時(shí)，6小時(shí)，8小時(shí)，10小時(shí)，抽取玻璃體標(biāo)本100μl，經(jīng)樣品預(yù)處理

8、后，應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)+質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)玻璃體中YC-1的濃度變化。并應(yīng)用DAS3.0藥物動(dòng)力學(xué)軟件及PKSolver2.0軟件，計(jì)算YC-1的藥物消除半衰期等藥物動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。
　　結(jié)果：結(jié)果表明，獼猴眼玻璃體液的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)YC-1及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定沒有干擾，保留時(shí)間分別為1.25和1.80 min，表明該方法專屬性良好。相關(guān)系數(shù)r均大于0.995，表明線性良好。藥物動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示在給藥后0.25小時(shí)，藥物濃度為1.217

9、μM，0.5小時(shí)為0.824μM，1小時(shí)為0.497μM，2小時(shí)為0.368μM，3小時(shí)為0.326μM，4小時(shí)為0.265μM，5小時(shí)為0.196μM6小時(shí)為0.145μM，8小時(shí)為0.083μM。經(jīng)軟件分析YC-1藥物半衰期為2.79小時(shí)。
　　結(jié)論：通過液質(zhì)聯(lián)用方法測(cè)量玻璃體內(nèi)YC-1藥物動(dòng)力學(xué)的變化，專屬性和精密度良好，可以應(yīng)用于YC-1在獼猴玻璃體腔中的藥物動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果符合預(yù)期的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。本研究通過觀察不同時(shí)間組YC

10、-1在玻璃體內(nèi)的質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)玻璃體內(nèi)YC-1質(zhì)量濃度隨時(shí)間的延長而迅速下降。YC-1在玻璃體內(nèi)的消除半衰期t1/2為2.79小時(shí)。
　　第二部分 YC-1玻璃體腔注射對(duì)正常獼猴眼部組織的毒性研究
　　目的：對(duì)YC-1玻璃體腔注射后其對(duì)眼部組織毒性問題進(jìn)行研究，以期對(duì)該藥在眼部應(yīng)用的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　方法：共3只實(shí)驗(yàn)用成年獼猴共6只眼睛，其中每只猴子右眼作為實(shí)驗(yàn)組，行YC-190μl（濃度為200μ

11、M）玻璃體腔注射，左眼作為對(duì)照組，行二甲基氬砜90μl（DMSO，濃度為0.01%）玻璃體腔注射。觀察時(shí)間點(diǎn)為術(shù)前和術(shù)后1天，1周，2周，1月。測(cè)量各實(shí)驗(yàn)眼眼壓、裂隙燈觀察結(jié)膜反應(yīng)、前房炎癥反應(yīng)以及角膜透明性，眼底照相機(jī)觀察眼底病變情況。相干光斷層掃描（optic coherence tomography，OCT）觀察黃斑區(qū)結(jié)構(gòu)，眼底熒光血管造影檢查血管病變情況。進(jìn)行暗適應(yīng)及明適應(yīng)ERG檢查。并在術(shù)后1月對(duì)摘除的眼球行光鏡組織學(xué)檢查。<

12、br>　　結(jié)果：YC-1玻璃體腔注射后各檢查時(shí)間點(diǎn)，所有眼球角膜透明，無前房反應(yīng)，也未見玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥。眼壓，黃斑中心厚度無明顯差異（P>0.05）。眼底血管造影未見血管異常改變。ERG檢查各組各時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組眼視桿細(xì)胞b波和視錐細(xì)胞a波和b波振幅與對(duì)照組眼相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織學(xué)檢查未見異常改變。
　　結(jié)論：應(yīng)用YC-1（90μl濃度為200μM）注射于正常獼猴眼玻璃體內(nèi)，無明顯

13、炎癥反應(yīng)，經(jīng)過1月的隨訪觀察，對(duì)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能無顯著性影響。
　　第三部分獼猴視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞的模型的建立及視網(wǎng)膜功能及結(jié)構(gòu)和玻璃體相關(guān)因子的測(cè)定
　　目的：探討多波長激光誘導(dǎo)獼猴視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞的可行性，觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能變化，為臨床進(jìn)一步認(rèn)識(shí)該疾病的轉(zhuǎn)歸提供參考。
　　方法：選擇6只健康成年獼猴，首先行裂隙燈，眼底檢查，OCT檢查，眼底熒光血管造影，ERG檢查及眼壓檢查，并確認(rèn)無眼部疾患后，應(yīng)用多波長激光的

14、黃光封閉6只獼猴的右眼視盤周圍所有主干靜脈，制成CRVO模型，隨后即刻行眼底熒光血管造影證實(shí)，并于術(shù)后6小時(shí)，1天，1周，2周，1月行相同檢查。同時(shí)在造模前和造模后各時(shí)間點(diǎn)行玻璃體腔抽取玻璃體液200μl。分別行CBA及ELASA檢測(cè)玻璃體細(xì)胞因子表達(dá)變化，包括：IL6，IL8，MCP-1及VEGF和HIF-1α。1個(gè)月后摘除眼球（每只獼猴摘除1眼，共3只左眼，3只右眼），進(jìn)行視網(wǎng)膜的HE染色及VEGF，HIF-1α，Caspase3的

15、免疫組化觀察研究。
　　結(jié)果：6只獼猴眼睛經(jīng)激光制作的CRVO模型經(jīng)FFA檢查均成功，結(jié)果顯示眼壓在術(shù)后1天及1周有輕度升高，但無顯著性差異（P<0.05），虹膜面可見新生血管，黃斑水腫在1天，1周，2周有顯著性升高（P<0.05），并于1月恢復(fù)到術(shù)前水平（P>0.05）。眼底可見廣泛火焰出血，ERG顯示視桿細(xì)胞b波和視錐細(xì)胞a波和b波顯著下降（P<0.05），眼底造影提示視網(wǎng)膜缺血滲漏明顯，并可見無灌注區(qū)及新生血管，符合人視網(wǎng)膜

16、中央靜脈阻塞的基本變化。通過CBA及ELASA檢測(cè)玻璃體炎癥因子IL-6,IL-8及MCP-1表達(dá)水平在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)了顯著升高（IL-6和IL-8從術(shù)后1天，MCP-1從術(shù)后2周）（P<0.05）。VEGF與HIF-1α表達(dá)也一致性升高，免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和VEGF在視網(wǎng)膜中表達(dá)明顯升高，并伴有凋亡蛋白 Caspase3的表達(dá)升高，光密度值均顯示三種蛋白表達(dá)顯著性升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：激光制作的CRV

17、O獼猴動(dòng)物模型在術(shù)后出現(xiàn)了典型的黃斑水腫，視網(wǎng)膜出血及無灌注區(qū)等體征。視網(wǎng)膜電圖顯示視網(wǎng)膜功能不同程度受到破壞。測(cè)量玻璃體和視網(wǎng)膜中VEGF，HIF-1α表達(dá)顯著升高，同時(shí)，玻璃體中炎癥因子IL-6，IL-8，MCP-1表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明血管生長因子及炎癥因子均參與了實(shí)驗(yàn)性CRVO的發(fā)病過程，激光所致獼猴CRVO可以模擬人類CRVO的發(fā)病過程，并為進(jìn)一步藥物干預(yù)治療提供理想的動(dòng)物模型。
　　第四部分 YC-1玻璃體腔注射治療獼

18、猴實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞的研究
　　目的：探討YC-1玻璃體腔注射后對(duì)CRVO獼猴動(dòng)物模型眼的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，功能及視網(wǎng)膜和玻璃體內(nèi)各種細(xì)胞因子的影響。
　　方法：選用健康成年獼猴6只，每只獼猴右眼為YC-1實(shí)驗(yàn)組，行玻璃體腔注射YC-1，左眼為DMSO對(duì)照組，行DMSO玻璃體腔注射。行激光制作CRVO動(dòng)物模型后，在術(shù)后1周，分別給予實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照YC-1和DMSO玻璃體腔注射，分別在注射前和注射后1天，1周，2周、1月使用裂隙

19、燈顯微鏡觀察角膜、房水、晶狀體、前節(jié)炎癥反應(yīng)情況；使用眼底照相，OCT及熒光眼底血管造影評(píng)估視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化情況，并行眼壓檢查。同時(shí)采取玻璃體樣本200μl，應(yīng)用CBA及ELASA檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)玻璃體樣本中VEGF、HIF-1α、IL-6、IL-8、MCP-1等細(xì)胞因子的表達(dá)。并行ERG視網(wǎng)膜電圖檢查評(píng)估視網(wǎng)膜功能情況。隨后在1個(gè)月時(shí)摘除眼球行 HE染色及視網(wǎng)膜免疫組化研究。通過免疫組化方法檢測(cè)視網(wǎng)膜中VEGF、HIF-1、Caspase3

20、的表達(dá)。
　　結(jié)果：YC-1實(shí)驗(yàn)組與DMSO對(duì)照組，經(jīng)注射藥物后，兩組均可見虹膜面新生血管，視網(wǎng)膜出血，無灌注區(qū)及新生血管。各時(shí)間點(diǎn)，兩組間眼壓未見顯著性差異(P<0.05)。OCT檢查可見黃斑區(qū)明顯水腫，給予 YC-1和 DMSO注射后，發(fā)現(xiàn)在 YC-1實(shí)驗(yàn)組，黃斑區(qū)水腫消退顯著。在注射后1天，1周和2周均較DMSO對(duì)照組有顯著性差異。ERG檢查發(fā)現(xiàn)，給予YC-1玻璃體腔注射后1周視網(wǎng)膜電圖的rod b波和cone a和b波均較

21、DMSO組有顯著改善。應(yīng)用YC-1玻璃體腔注射后，IL-6、IL-8均得到明顯的抑制，而MCP-1盡管有輕度降低，但與DMSO對(duì)照組比較沒有顯著性差異。此外，在應(yīng)用YC-1后，玻璃體中HIF-1α和VEGF的表達(dá)顯著降低，HE染色發(fā)現(xiàn)YC-1和DMSO二組的視網(wǎng)膜內(nèi)核層和外核層細(xì)胞均較正常視網(wǎng)膜顯著減少。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)在YC-1治療組，視網(wǎng)膜中HIF-1α，VEGF及 Caspase3三種抗體的表達(dá)均顯著受到抑制，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量

22、了三種抗體在視網(wǎng)膜表達(dá)的光密度值，證實(shí)了三種蛋白表達(dá)均較DMSO組顯著降低。
　　結(jié)論：在造模后一周時(shí)，YC-1玻璃體腔注射后，可以顯著改善黃斑水腫的程度，加快水腫吸收，改善ERG中視桿細(xì)胞b波和視錐細(xì)胞的a波和b波的波幅。同時(shí)抑制IL-6、IL-8、VEGF、HIF-1α在玻璃體內(nèi)的表達(dá)，輕度抑制MCP-1的表達(dá)。在視網(wǎng)膜中降低VEGF和HIF-1α的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞有保護(hù)作用。
　　基于上述研究結(jié)果可以得

23、出以下結(jié)論：
　　1應(yīng)用YC-1玻璃體腔注射對(duì)獼猴眼睛無明顯毒性反應(yīng)，對(duì)視網(wǎng)膜功能及結(jié)構(gòu)無明顯影響。
　　2多波長激光制作獼猴CRVO動(dòng)物模型，可實(shí)現(xiàn)模擬人眼CRVO的表現(xiàn)，其視網(wǎng)膜體征和功能均有一定相似性，可作為理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)行相關(guān)的藥物研究。
　　3應(yīng)用YC-1玻璃體腔注射治療激光誘導(dǎo)的獼猴CRVO動(dòng)物模型，結(jié)果表明YC-1可以減輕黃斑水腫程度，改善視網(wǎng)膜功能，迅速抑制CRVO引起的玻璃體和視網(wǎng)膜中各種炎癥因子