過氧化氫誘導(dǎo)弓形蟲RH株速殖子凋亡的初步研究.pdf

1、剛地弓形蟲病是一種在全球內(nèi)普遍流行的人獸共患寄生蟲病。不僅對(duì)孕婦和胎兒構(gòu)成了極大的威脅，近年來(lái)又成為AIDS等免疫功能缺陷患者死亡的重要因素之一。目前抗弓形蟲藥物大部分都存在長(zhǎng)期治療效果差、難根治、高費(fèi)用且對(duì)免疫功能缺陷患者基本無(wú)治療效果等諸多缺點(diǎn)，研發(fā)新型治療弓形蟲病藥物很有必要。藥物研究依賴于高效穩(wěn)定的弓形蟲體內(nèi)和體外培養(yǎng)模型，建立弓形蟲培養(yǎng)模型不僅可用于篩選新型抗弓形蟲藥物，還可用于抗弓形蟲藥物的作用機(jī)理研究。過氧化氫(Hydro

2、gen Peroxide，H2O2)對(duì)細(xì)胞的活力和增殖力均具有抑制和/或殺傷作用，然而有關(guān)H2O2能否誘導(dǎo)弓形蟲凋亡的作用機(jī)制仍然不清楚。近年來(lái),不少數(shù)據(jù)表明，H2O2可以誘導(dǎo)眾多細(xì)胞凋亡，本文以H2O2是否能誘導(dǎo)弓形蟲速殖子凋亡作探討，旨在進(jìn)一步闡明H2O2誘導(dǎo)弓形蟲RH株凋亡的機(jī)制，為弓形蟲病的免疫預(yù)防和臨床治療新方案的設(shè)計(jì)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。復(fù)蘇剛地弓形蟲RH株速殖子，注射接種小鼠腹腔；建立蟲體與小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）細(xì)

3、胞的共同培養(yǎng)體系，依次以不同比例的蟲體接種細(xì)胞，觀察蟲體在細(xì)胞內(nèi)的增殖情況，確定適宜的蟲體與細(xì)胞感染比例及培養(yǎng)時(shí)間。以濾膜過濾法純化體內(nèi)培養(yǎng)和體外培養(yǎng)模型獲得速殖子。采用吉姆薩染色、瓊脂糖凝膠電泳、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）、流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定 DNA含量檢測(cè) H2O2處理弓形蟲速殖子凋亡的特征；檢測(cè)凋亡過程中胞內(nèi)鈣離子濃度變化。RH株速殖子可在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)增殖，接種72h后細(xì)胞能完全被破壞釋放出大量蟲體，蟲體

4、在細(xì)胞內(nèi)增殖速度和傳代間隔穩(wěn)定、形態(tài)典型，未見毒力明顯減弱。兩種濾膜對(duì)體內(nèi)白細(xì)胞清除率無(wú)明顯差異，對(duì)紅細(xì)胞清除效果隨濾膜孔徑增大依次降低，小鼠體內(nèi)速殖子的回收率隨著孔徑增大依次升高。兩種濾膜對(duì)RAW264.7細(xì)胞的清除率無(wú)明顯差異,體外培養(yǎng)的速殖子的回收率隨著濾膜孔徑增大而升高，并且兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。光鏡下觀察H2O2處理弓形蟲后，蟲體失去典型形態(tài)，活力明顯下降。瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定H2O2處理速殖子后的DNA未見片段化條帶，以流式