PGAM1在mTOR誘導(dǎo)腫瘤有氧糖酵解中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖代謝異常被認(rèn)為是腫瘤的重要特征之一。上世紀(jì)20年代德國(guó)科學(xué)家Otto Warburg首先發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞無(wú)論氧氣充足與否，均選擇進(jìn)行產(chǎn)能效率較低的糖酵解途徑，葡萄糖消耗、糖酵解速率以及乳酸生成均較正常細(xì)胞明顯增加，因此稱(chēng)為“Warburg效應(yīng)”或“有氧糖酵解”。然而，腫瘤細(xì)胞為什么會(huì)發(fā)生糖酵解，其在腫瘤發(fā)生中的作用及機(jī)制等，仍有待于進(jìn)一步研究。
　　哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，

2、mTOR)通路活化是腫瘤中最常見(jiàn)的信號(hào)通路異常。該通路中的抑癌基因如結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體1/2（Tuberoussclerosis complex1/2，TSC1/2）和人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的失活均可以導(dǎo)致mTOR通路過(guò)度活化，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。我們的前期研究表明，mTOR通路活化能夠促進(jìn)W

3、arburg效應(yīng)的發(fā)生。
　　磷酸甘油酸變位酶1（Phosphoglyceratemutase1，PGAM1）是糖酵解途徑中重要的催化酶之一，在多種腫瘤組織中有高表達(dá)，且與糖代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。然而，其在腫瘤中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制并不是很清楚。為探討PGAM1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的可能機(jī)制，以及PGAM1在mTOR通路活化導(dǎo)致的有氧糖酵解和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，本課題研究分為以下三個(gè)部分：
　　第一部分，利用Tsc2和Pten敲除導(dǎo)致

4、mTOR通路活化的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF）與野生型MEF進(jìn)行比較，觀(guān)察PGAM1的表達(dá)及酶活性變化，并加入mTOR抑制劑雷帕霉素進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。ELT3是Tsc2缺失的細(xì)胞系，其mTOR通路也是活化的，我們通過(guò)使用雷帕霉素處理或在ELT3中轉(zhuǎn)入TSC2來(lái)抑制mTOR通路，進(jìn)一步觀(guān)察PGAM1表達(dá)與酶活性的變化。此外，我們?cè)?Tsc2雜合小鼠腎臟腫瘤與野生型小鼠腎臟組織中比較了PG

5、AM1的表達(dá)。同時(shí)，我們?cè)谌朔伟┙M織及癌旁組織中觀(guān)察PGAM1的表達(dá)。最后，在Tsc2-/-、Pten-/-MEF中穩(wěn)定敲低缺氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia inducible factor1α，HIF1α）來(lái)檢測(cè)mTOR是否通過(guò)HIF1α來(lái)調(diào)節(jié)PGAM1表達(dá)，并通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）驗(yàn)證HIF1α對(duì)PGAM1的表達(dá)調(diào)控。結(jié)果顯示：PGAM1的蛋白表達(dá)和酶活性在m

6、TOR通路活化的MEF中升高。ELT3細(xì)胞中恢復(fù)TSC2表達(dá)或加入雷帕霉素可以降低PGAM1的表達(dá)和酶活性。PGAM1蛋白的上調(diào)也存在于Tsc2雜合小鼠的腎臟腫瘤組織和人肺癌組織。mTOR通路活化MEF中敲低HIF1α可下調(diào)PGAM1表達(dá)，ChIP進(jìn)一步證明了mTOR通路通過(guò)HIF1α介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)上調(diào)PGAM1的表達(dá)。
　　第二部分，利用RNA干擾技術(shù)在Tsc2-/-和Pten-/-MEF中敲低PGAM1，觀(guān)察細(xì)胞葡萄糖消耗和

7、乳酸生成，即Warburg效應(yīng)的變化。同時(shí)利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察PGAM1敲低后對(duì)細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力的影響。將Pten-/-PGAM1敲低的MEF與對(duì)照MEF接種裸鼠，觀(guān)察兩組裸鼠的無(wú)瘤生存期和總生存期。結(jié)果顯示：PGAM1蛋白表達(dá)下降可以降低mTOR通路活化導(dǎo)致的Warburg效應(yīng)，并且下調(diào)了細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力。接種PGAM1敲低的Pten-/- MEF裸鼠無(wú)瘤生存期和總生存期均長(zhǎng)于對(duì)照組裸鼠，說(shuō)明PGA

8、M1在腫瘤形成及生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用。
　　第三部分，收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）術(shù)后癌組織與癌旁組織28對(duì)，檢測(cè)其PGAM1信使RNA（message RNA，mRNA）表達(dá)的不同。收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院227例 NSCLC和30例結(jié)直腸癌術(shù)后石蠟組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)標(biāo)本中PGAM1和磷酸化核糖體蛋白S6（Phospho-ribosoma

9、l proteinS6，pS6）表達(dá)，分析兩者之間的相關(guān)性及其與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示：在NSCLC中，癌組織PGAM1的表達(dá)高于癌旁組織。在NSCLC與結(jié)直腸癌中，PGAM1高表達(dá)的患者總生存期（Overall survival，OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（Progressionfree survival，PFS）均較低表達(dá)的患者差，且PGAM1表達(dá)與mTOR通路活化具有顯著相關(guān)性。
　　綜上所述，得出以下結(jié)論：
　　1)mT