Tet-on調控報告基因酪氨酸酶用于光聲、PET及MRI多模態(tài)顯像的實驗研究.pdf

1、目的：放射性核素標記苯甲酰胺（benzamide, BZA）類小分子化合物具備與黑色素特異性結合的特性。本研究制備一種新型18F標記苯甲酰胺類似物，18F-5-氟-N-(2-(二乙氨基)乙基)吡啶甲酰胺（18F-5-fluoro-N-(2-(Diethylamino)ethyl)picolinamid，并命名為18F-5-FPN，研究通過體外細胞實驗和在體顯像實驗，評估其對惡性黑色素瘤的靶向能力和體內代謝特點。
　　方法：利用GE

2、公司的FX-XN合成模塊18F-與前體5-溴-N-(2-(二乙胺基)乙基)吡啶甲酰胺（5-bromo-N-(2-(diethylamino) ethyl)picolinamide）之間發(fā)生親核取代反應得到產(chǎn)物18F-5-FPN，通過高效液相色譜（high performance liguid chromatography,HPLC）對產(chǎn)物進行純化及鑒定。體外培養(yǎng)小鼠皮膚黑色素瘤細胞 B16F10（產(chǎn)生黑色素）和人惡性黑色素瘤細胞 A37

3、5m（不產(chǎn)生黑色素），利用細胞飽和、攝取及阻斷等體外實驗探討其在體外與黑色素結合的特異性。荷B16F10瘤鼠注射顯像劑18F-5-FPN（3.7–5.55MBq）1min后，應用小動物正電子發(fā)射斷層掃描（micro-positron emission tomography, microPET）獲取動態(tài)顯像圖，以研究該探針在活體內的代謝特點。注射顯像劑后1、2 h，荷B16F10和A375m移植瘤裸鼠行microPET靜態(tài)顯像、生物分布實

4、驗探討其在體內特異性靶向黑色素的能力。荷B16F10裸鼠在18F-5-FPN PET顯像后第二天行18F-FDG PET顯像，比較兩種探針對荷B16F10瘤鼠的特異性靶向能力。B16F10肺轉移模型分別于14、21天行PET顯像，進一步探討了18F-5-FPN對黑色素瘤肺部轉移病灶的探測能力。
　　結果：應用FX-XN合成模塊成功標記并純化18F-5-FPN，標記率為5％~8%（n=5），其放化純大于95%，比活度為100~120

5、 GBq/μmol，體外穩(wěn)定性好，3 h放化純仍大于95%。細胞攝取實驗顯示 B16F10細胞在各個時間點對18F-5-FPN的攝取明顯高于A375m細胞，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中1 h細胞攝取達到峰值，分別為7.29±0.61%和1.05±0.09%(n=3)。PET動態(tài)顯像研究顯示腫瘤部位放射性攝取隨時間逐漸增加，18F-5-FPN主要經(jīng)腎臟快速排泄。PET靜態(tài)顯像B16F10腫瘤顯示清晰，生物分布研究相應部位1 h

6、和2 h的放射性攝取分為24.34±6.32、16.63±5.41%ID/g(n=5)，而A375m腫瘤未見顯影，其放射攝取值僅為1.75±0.92、0.61±0.12%ID/g。在過量標準品19F-5-FPN與18F-5-FPN共注射后，大部分器官放射性攝取率明顯低于未阻斷組，1 h腫瘤部位放射性攝取值僅為1.36±0.37%ID/g（n=4）。感興趣區(qū)定量分析發(fā)現(xiàn)18F-5-FPN探針PET顯像對應腫瘤/背景比值明顯高于18F-FD

7、G探針，分別為35.22±7.02和3.29±0.53，前者是后者的10倍左右。18F-5-FPN探針能及時探測到B16F10肺轉移模型內微小轉移病灶（直徑1~2 mm）。
　　結論：本研究證實了18F-5-FPN可在體內/外特異性靶向黑色素，腫瘤部位親和力高且顯像劑滯留明顯、理想的藥代動力學特征，可以作為一種無創(chuàng)的分子探針用于黑色素瘤早期診斷及分期。
　　目的：構建以酪氨酸酶（tyrosinase, TYR）作為報告基因的

8、Tet-on基因誘導表達系統(tǒng)，并以慢病毒包裝，通過細胞體外實驗，初步探討應用單一報告基因TYR進行核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)、光聲顯像(photoacoustic imaging, PAI）及正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography, PET)多模態(tài)顯像的可行性。
　　方法：通過基因工程方法將TYR報告基因連接到帶有篩選標志的Lenti-X T

9、et-on3G基因誘導表達系統(tǒng)中構建 Tet-on慢病毒載體，然后將其轉染至人乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞并通過嘌呤霉素篩選單克隆穩(wěn)定細胞系。轉染后的231細胞用強強力霉素（doxorubicin, Dox）處理后被當做陽性細胞（命名為231-Tyr+Dox）和轉染后231細胞未用Dox處理（命名為231-Tyr）和未轉染的231細胞（命名為231）均被陰性對照組。應用Western Blot（WB）、黑色素Masson-Fon

10、tana染色、細胞免疫熒光等實驗評估不同組細胞目的基因酪氨酸酶的表達。對不同實驗組、不同濃度的細胞進行MRI顯像和PAI顯像。制備PET探針18F-5-氟-N-(2-(二乙氨基)乙基)吡啶甲酰胺（18F-5-fluoro-N-(2-(Diethylamino)ethyl)picolinamid，被命名為18F-5-FPN），對不同分組細胞進行的細胞攝取和阻斷實驗。
　　結果：成功制備以慢病毒為載體、Tet-on調控含TYR目的基因

11、的重組系統(tǒng)，并通過轉染，篩選并培養(yǎng)穩(wěn)定表達細胞系。通過WB、Masson-Fontana染色、細胞免疫熒光結果顯示僅有231-Tyr細胞在誘導劑Dox誘導后表達目的基因TYR。通過改變Dox孵育的劑量和時間對231-Tyr細胞黑色素產(chǎn)量進行精確調控。黑色素產(chǎn)量與Dox濃度正相關，當濃度為2000 ng/mL時達到飽和。MRI細胞顯像顯示231-Tyr+Dox細胞較對照組明顯縮短了T1和T2弛豫時間，且T2弛豫時間縮短程度更明顯。PAI細

12、胞顯像僅在231-Tyr+Dox細胞探測到PAI信號，且隨著細胞濃度增加而增加。細胞攝取實驗顯示，231-Tyr+ Dox細胞對18F-5-FPN的攝取在60 min時最高，細胞攝取值為4.80±0.16%（n=4），阻斷實驗細胞攝取以對照組為參照其抑制率為54.7±3.34%，說明18F-5-FPN與TYR基因產(chǎn)物黑色素特異性靶向能力。
　　結論：本研究驗證了人TYR基因通過轉染，可在非黑色素MDA-MB-231細胞中誘導黑色素