TBX21基因啟動子rSNP功能鑒定及其與Th1-Th2分化關系的研究.pdf

1、T-bet是Th1特異性轉錄調節(jié)因子，屬T-box蛋白家族成員。T-bet上調IFN-γ轉錄和IL-12Rβ2表達，提高T細胞對IL-12信號傳遞的敏感性，從而促進初始Th細胞分化為Th1細胞[1]。目前已發(fā)現(xiàn)在人體CD4+T細胞、NK細胞、CD8+效應T細胞中表達T-bet，且與宿主炎癥反應、抗病原體免疫應答關系密切[2, 3]。對孿生子研究還發(fā)現(xiàn)，宿主遺傳因素對TBX21基因(其編碼T-bet)表達及其調控的Th1細胞分化起主要作用

2、；Th2 應答不受遺傳因素影響, 而受T-bet 誘導的Th1應答所調控[4]。
　　 人類基因組中存在廣泛的多態(tài)性，基因組序列的差異構成了不同個體與群體對疾病的易感性、對藥物與環(huán)境因子不同反應的遺傳基礎。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism，SNP）是人類基因組中分布廣泛、密度高、易于批量檢測且相對穩(wěn)定的第三代遺傳標記，在復雜疾病的基因定位、關聯(lián)分析、個體和群體對環(huán)境致病因子與藥物的易感性

3、研究中得到廣泛應用[5]。
　　 啟動子核苷酸序列的遺傳變異可導致一些復雜遺傳疾病關聯(lián)基因表達量的改變。
　　 宿主遺傳因素決定的IFN-γ水平降低可促進機體免疫耐受形成。對TBX21基因外顯子和啟動子的掃描顯示，T-1993C SNP為日本人和高加索人群中最常見多態(tài)。T-1993C多態(tài)性與日本人和高加索人群的哮喘發(fā)病有關[6]，且體外功能實驗證實T-1993C 多態(tài)性可影響TBX21基因的轉錄活性[7]。我們對中國人群

4、的TBX21基因SNP分析顯示，T-1993C 多態(tài)性與慢性HBV 感染[8]、自身免疫性肝炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡關聯(lián)[9]。這些免疫性疾病發(fā)生可能與免疫耐受的缺失或免疫反應受到抑制的分子遺傳機制有關。
　　 遺傳關聯(lián)研究不能說明TBX21基因功能是直接受T-1993C 多態(tài)性影響，還是受與T-1993C SNP 連鎖不平衡的其他多態(tài)性位點影響。為更好地弄清T-bet表達的調控機制及其關聯(lián)的自身免疫性疾病、變應性和感染性疾病的宿主易

5、感性, 本研究采用電泳遷移率分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、染色質免疫沉淀分析(chromatin immunoprecipitation, ChIP), 證實-1993 位點的等位特異性順式調控作用; 同時, 以健康體檢者外周血為研究對象, 采用流式細胞檢測技術觀察-1993 位點T/C等位變異對正常人群CD4+T淋巴細胞TBX21表達量（蛋白水平）及Th1/Th2 應答的

6、影響，以期深入認識TBX21基因調節(jié)性SNP（regulatory SNP，rSNP）在感染性疾病、自身免疫性疾病及變應性疾病中的作用。
　　 1.轉錄因子YY1與TBX21基因-1993T/C 位點區(qū)域結合的確定生物信息分析顯示，TBX21基因啟動子-2211至-1712 區(qū)域包含一個轉錄因子YY1結合的保守序列，T-1993C SNP 相鄰YY1結合的保守序列（AAATGG）。采用-1993T和-1993C等位寡核苷酸探針進

7、行競爭抑制實驗顯示，YY1與T和C等位均特異性結合，但其與C等位親和力明顯高于T等位。T、C等位探針交叉抑制實驗進一步證實，同等濃度時C等位可以將T等位結合條帶完全抑制，而T等位卻不能將C等位結合條帶完全抑制；YY1冷探針可以將T、C等位結合的慢遷移率結合帶完全抑制，而突變YY1冷探針則不能抑制慢遷移率結合帶。采用YY1抗體進行超漂移實驗證實，與T和C等位結合的慢遷移率條帶包含轉錄因子YY1。同時, 我們利用人CD4+T淋巴細胞株jur

8、kat 進行ChIP分析，進一步確定YY1與TBX21基因啟動子區(qū)包含-1993位點序列發(fā)生結合。
　　 2.重慶人群TBX21基因T-1993C 多態(tài)性的分布狀況我們對收集的370例健康獻血員的全血標本基因組DNA 進行PCR-限制性內切酶長度多態(tài)分析，結果顯示：370例標本中，-1993TT基因型為279例(76％),-1993TC基因型為86例(23％),-1993CC基因型為5例(1％），-1993T/C等位頻率為13％

9、。
　　 3.-1993T/C基因型與TBX21表達量和CD4+T細胞應答的關系在-1993 位點分型標本中，我們隨機選取17例，其中，TT基因型和TC基因型各7例，CC基因型3例。再次采集全血，采用五色流式細胞檢測技術對T-bet、IFN-γ
　　 及IL-4水平進行檢測，結果顯示，T-bet和IFN-γ的表達量從TT→TC→CC基因型呈遞減趨勢，而IL-4表達量則呈遞增趨勢，且不同基因型個體的各種因子之間存在顯著差異