長鏈非編碼RNAMEG3對(duì)人膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、長鏈非編碼RNA(long non－coding RNA，LncRNA)原先在基因組中普遍被視為“轉(zhuǎn)錄垃圾”，是不含有任何功能作用的無效的核苷酸片段。最近研究得知，盡管lncRNA不編碼蛋白質(zhì)，但它涉及生命活動(dòng)與生理過程的很多環(huán)節(jié)，可通過若干信號(hào)通路間接地對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。膀胱癌的發(fā)病率在所有泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中名列榜首，是最常見的泌尿系腫瘤。其頻繁地發(fā)病與復(fù)發(fā)一直困擾著泌尿外科大夫與患者，且膀胱癌的病因機(jī)制皆不清楚。因此，研

2、究膀胱癌的發(fā)生與進(jìn)展在分子生物學(xué)水平上的相關(guān)機(jī)制，探求明顯的標(biāo)志物與可利用的治療靶點(diǎn)對(duì)患者的治療相當(dāng)重要。當(dāng)前l(fā)ncRNA與膀胱癌的聯(lián)系逐漸受到學(xué)術(shù)界的重視，尤其是LncRNA MEG3在很多腫瘤中表達(dá)水平明顯降低，于是被推測具有抑制癌癥的功效，包括抑制癌癥的生長、浸潤與轉(zhuǎn)移等，但是長鏈非編碼RNA MEG3對(duì)膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的作用以及作用機(jī)制尚不清楚。
　　目的:
　　1.檢測MEG3在膀胱癌中的表達(dá)水平高低，并探討MEG

3、3的表達(dá)水平高低和臨床膀胱癌分級(jí)、分期之間的聯(lián)系；
　　2.研究長鏈非編碼RNA MEG3對(duì)人膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡、上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移的作用及分子機(jī)制研究；
　　方法:
　　1.收集來協(xié)和醫(yī)院做膀胱全切手術(shù)的病例35個(gè)，再剪取標(biāo)本中的癌組織以及毗鄰正常組織，然后提取RNA并接著逆轉(zhuǎn)錄，最后檢測MEG3的相對(duì)表達(dá)量，并且探討MEG3的表達(dá)水平和臨床分級(jí)、分期的聯(lián)系；
　　2.生物公司合成MEG3 siRNA

4、用以干擾MEG3的表達(dá)水平，人工構(gòu)建MEG3過表達(dá)載體pCDNA-MEG3用以升高M(jìn)EG3的表達(dá)水平，與lipol2000一起分別轉(zhuǎn)染到T24、EJ中；
　　3.MEG3對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡、上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移的作用：MTT檢測膀胱癌細(xì)胞的生存率，克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估膀胱癌細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測膀胱癌細(xì)胞凋亡率與周期，劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell小室評(píng)估對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響。
　　4.以MEG3 siRNA與

5、pCDNA-MEG3為處理因素，Western Blot檢測不同處理因素對(duì)膀胱癌細(xì)胞Bcl-2、Bax、Cleaved caspase3、Cyclin D1、Vimentin、Snail、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.35例病例中27例MEG3低表達(dá)（77.14％）；非肌層浸潤性膀胱癌低表達(dá)的患者占總數(shù)的百分比為55.56%，肌層浸潤性膀胱癌中低表達(dá)的患者占總數(shù)的百分比為94.12%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

6、中的低表達(dá)患者所占的百分比為72.73%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的低表達(dá)患者所占的百分?jǐn)?shù)為75.00%；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的低表達(dá)患者所占百分比為81.25%，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的低表達(dá)患者所占百分比為66.67%。
　　2.干擾MEG3后膀胱癌細(xì)胞凋亡率下降，G0/G1期膀胱癌細(xì)胞數(shù)明顯減少，膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移能力增強(qiáng)，增值率上升；過表達(dá) MEG3后膀胱癌細(xì)胞凋亡率升高，G0/G1期膀胱癌細(xì)胞數(shù)明顯增多，膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移能力下降，增值率下降。

7、
　　3.干擾MEG3后能上調(diào)膀胱癌細(xì)胞Bcl-2、Cyclin D1、Vimentin、Snail的表達(dá)水平，抑制Bax、Cleaved caspase3、E-cadherin的表達(dá)。
　　4.過表達(dá)MEG3后能上調(diào)膀胱癌細(xì)胞Bax、Cleaved caspase3、E-cadherin的表達(dá)水平，抑制Bcl-2、Cyclin D1、Vimentin、Snail的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.與毗鄰正常黏膜相比，

8、MEG3在癌組織中表達(dá)水平明顯降低，并且非肌層浸潤性膀胱癌中發(fā)生低表達(dá)的比例更低。此外，MEG3表達(dá)水平高低與膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系沒有特殊意義；
　　2. MEG3誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，對(duì)人膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲有抑制效應(yīng)，而增加了膀胱癌細(xì)胞的凋亡。
　　3. MEG3可能介導(dǎo)Bax、Bcl-2、Cyclin D1、Cleaved caspase3調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的增殖與凋亡，通過Vimentin、Snail、