維吾爾藥大苞荊芥對哮喘小鼠TGF-β-Smads通路的影響及Th17-Treg調節(jié)機制研究.pdf

1、目的：研究哮喘患者Th1、Th2、Th17及Treg細胞相關炎性因子的變化規(guī)律，探索哮喘肺內炎癥發(fā)生發(fā)展的分子機制。通過大苞荊芥對支氣管哮喘小鼠的干預實驗，探討維藥大苞荊芥對支氣管哮喘小鼠模型TGF-β/Smads信號通路介導Th17/Treg平衡的調節(jié)作用機制并評價并分析大苞荊芥對兩者的調節(jié)作用。
　　方法：⑴采用多重蛋白定量技術（CBA法）檢測支氣管哮喘患者及正常人群血清中 Th1、Th2、Th17及Treg細胞相關細胞因子的

2、蛋白表達變化；⑵將支氣管哮喘模型小鼠分為6組，分別為正常對照組、哮喘模型組、地塞米松治療組、大苞荊芥高劑量治療組、大苞荊芥中劑量治療組及大苞荊芥低劑量治療組。釆用卵清蛋白（OVA）聯(lián)合 Al（OH）3致敏法制備小鼠支氣管哮喘模型；觀察小鼠的行為學變化，采用肺組織切片HE染色觀察、氣道阻力測定、氣道肺泡灌洗液中炎性細胞分類計數(shù)結果，測定氣道高反應性；⑶流式細胞術檢測支氣管哮喘模型小鼠 Th17/Treg細胞特異性標志物IL-17a+Th1

3、7、Foxp3+Treg及Th17/Treg比值的變化情況；⑷采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Quantitative Real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測支氣管哮喘小鼠Th17/Treg細胞相關細胞因子IL-10、IL-17a、IL-23、RORγt轉錄水平變化情況，以及TGF-β/Smads信號通路中細胞相關細胞因子IL-6、Smad2/3、Smad7、TGF-β轉錄水平變化

4、情況；⑸酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測各組小鼠血清中Th17/Treg細胞相關細胞因子IL-10、IL-17a、IL-6、TGF-β水平的變化情況，以及支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）中IL-4水平的變化情況。Western-Blot法測定 pSmad2/3、pSmad7蛋白的表達情況。
　　結果：①在支氣管哮喘患者血清中TGF-β（Treg）、IL-4（Th2）、IL-

5、6、IL-17a（Th17）的細胞因子表達水平明顯高于正常人群，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在支氣管哮喘患者與正常人群血清中 IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的表達水平未見明顯差異（P＞0.05）；②通過對小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）炎性細胞進行分類計數(shù)發(fā)現(xiàn)：支氣管哮喘小鼠模型中淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞計數(shù)明顯增高，巨噬細胞計數(shù)明顯降低；支氣管哮喘模型小鼠的細胞分類以嗜酸性粒細胞為主；通過測定各組間小鼠

6、氣道阻力的影響，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比各組間氣道阻力具明顯增加。哮喘模型組乙酰膽堿激發(fā)后可見，小鼠氣道阻力明顯增加，與其他各組相比差異明顯且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。四個治療組（地塞米松及大苞荊芥）經(jīng)乙酰膽堿激發(fā)后氣道阻力較正常組均增加，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但哮喘小鼠模型組相比較后我們可以發(fā)現(xiàn)，四個治療組（地塞米松及大苞荊芥）氣道阻力均明顯減小差異有統(tǒng)計學意義。治療組各組間地塞米松組與大苞荊芥各組相比氣道阻力增加不明顯

7、，大苞荊芥各治療組氣道阻力依大苞荊芥劑量遞減而逐漸增強。高劑量組氣道阻力較低，低劑量組氣道阻力較高。HE染色結果顯示，哮喘模型組小鼠支氣管及肺泡組織結構發(fā)生改變，部分結構消失。支氣管粘膜可見大量炎癥細胞浸潤，支氣管出現(xiàn)收縮的現(xiàn)象，管腔變窄，氣道上皮排列不整齊，甚至出現(xiàn)斷裂的情況。治療組較模型組的炎癥細胞浸潤情況明顯減輕；支氣管收縮較模型組好轉；管腔變窄情況模型組明顯改善，管腔直徑較模型組明顯變寬；③流式細胞術檢測結果顯示：地塞米松組及不

8、同劑量干預組Th17細胞百分比均明顯高于空白對照組（P＜0.01），同時均低于支氣管哮喘小鼠模型組（P＜0.01）。地塞米松組及不同劑量干預組Treg細胞百分比均明顯低于空白對照組（P＜0.01），同時均高于支氣管哮喘小鼠模型組（P＜0.01）。地塞米松組及不同劑量干預組Th17/Treg細胞比值均明顯高于空白對照組（P＜0.01），同時均低于支氣管哮喘小鼠模型組（P＜0.01）；④qRT-PCR結果顯示：TGF-β/Smad信號通路相

9、關細胞因子IL-6、IL-10、IL-17a、Smad2/3、Smad7、TGF-β的mRNA水平在支氣管哮喘模型小鼠中均有明顯改變。在各支氣管哮喘模型小鼠組中IL-6、IL-17a、Smad2/3、TGF-βmRNA的表達均顯著高于對照組；地塞米松可以顯著降低模型組中 IL-6、IL-17a、Smad2/3、TGF-β的mRNA表達情況，大苞荊芥也可以降低模型組中IL-6、IL-17a、Smad2/3、TGF-β的mRNA表達。在各支

10、氣管哮喘模型小鼠組中Smad7的mRNA的表達均顯著低于對照組；地塞米松與大苞荊芥都可以顯著增加模型組中Smad7的mRNA表達；⑤ELISA結果顯示：炎性細胞相關因子IL-4、IL-10、IL-17a、IL-6、TGF-β在支氣管哮喘模型小鼠中均有明顯改變。大苞荊芥能夠降低支氣管哮喘小鼠模型 BALF中 IL-4的表達水平及外周血IL-17a、IL-6、pSmad2/3、TGF-β的表達水平，與此同時增加了外周血IL-10的表達水平。

11、Western-blot結果顯示：在支氣管哮喘模型小鼠組中pSmad2/3的表達均顯著高于對照組（P＜0.01），而pSmad7的表達明顯低于對照組；地塞米松可以顯著降低模型組中pSmad2/3的表達，也可以顯著增加模型組中pSmad7的表達，大苞荊芥也起到相似的作用。
　　結論：⑴支氣管哮喘患者外周血中存在CD4+T淋巴細胞免疫失衡，哮喘組患者血清中TGF-β、IL-4、IL-6、IL-17a的表達水平明顯高于正常人群，提示哮喘

12、組Th17細胞表達較正常組顯著增加，通過調節(jié)Th17/Treg細胞比例，可能對干預支氣管哮喘進程具有一定的作用；⑵通過OVA氣道致敏法，可成功建立支氣管哮喘小鼠模型；建立的支氣管哮喘模型小鼠的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎細胞分類以嗜酸性粒細胞為主；支氣管哮喘模型小鼠氣道阻力明顯增高；初步確認大苞荊芥可以顯著改善支氣管哮喘模型小鼠的癥狀，改善支氣管肺泡的病理學變化；降低支氣管哮喘模型小鼠的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎性細胞數(shù)量；降

13、低支氣管哮喘模型小鼠的氣道高反應性；⑶地塞米松和大苞荊芥能夠使 Th17細胞數(shù)量減少同時使得 Treg細胞增加。大苞荊芥和地塞米松均可以顯著的恢復Th17/Treg細胞分化的平衡的能力。提示大苞荊芥可能通過某種方式參與Th17/Treg細胞分化及相關細胞因子的調節(jié)；⑷研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號是初始T細胞分化成Th17與Treg細胞時必不可少的信號分子之一，TGF-β與IL-6的協(xié)同作用在Th17細胞分化中起到十分重要的作用，Smad2/3

14、與Smad7的磷酸化也是影響 Th17細胞分化的重要調控因素之一；⑸本研究通過建立并觀察小鼠支氣管哮喘模型，發(fā)現(xiàn)在支氣管哮喘發(fā)生時，炎癥反應隨之發(fā)生，TGF-β/Smad通路上的關鍵細胞因子TFG-β與Smad2/3、IL-6的表達皆有升高，TGF-β/Smad通路被激活，與此同時Th17/Treg細胞比值表現(xiàn)出明顯上升；⑹而在地塞米松及大苞荊芥的作用下，該通路中TGF-β，IL-6與磷酸化的Smad2/3皆隨之下降，而磷酸化的Smad

15、7則開始上調，而此時也伴隨著Th17/Treg細胞比值明顯下降。由此我們推測TGF-β/Smad在支氣管哮喘的發(fā)生過程中起到促炎的作用；⑺而大苞荊芥可能通過調節(jié)小鼠體內TGF-β/Smad通路下游關鍵信號分子Smad2/3及Smad7的磷酸化進而影響TGF-β與IL-6的表達，進一步影響調節(jié)Th17與Treg的分化，從而對小鼠支氣管哮喘的炎癥產生抑制作用，而對于探明大苞荊芥的有效作用靶點和更深一步的影響作用機制而言還需要在以后的研究工作