蛋白酶體抑制劑克服慢性粒細胞性白血病對伊馬替尼耐藥的體內(nèi)外研究.pdf

1、背景與目的:慢性粒細胞性白血?。–ML）的特點是Bcr-Abl酪氨酸激酶的活化。Bcr-Abl基因T315I突變是導(dǎo)致伊馬替尼、細胞毒性藥物和第二代酪氨酸激酶抑制劑耐藥的主要突變類型。慢性粒細胞性白血病患者對伊馬替尼耐藥的出現(xiàn)，促使人們尋找治療慢性粒細胞性白血病的新方法。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，在蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制和各種細胞進程中調(diào)控降解。因此，蛋白酶體抑制劑已經(jīng)成為潛在的有吸引力的抗癌藥物。26S蛋白酶體是由20

2、S核心顆粒（CP），和一端或兩端的19S調(diào)節(jié)顆粒（RP）蓋子結(jié)構(gòu)組裝而成。去泛素化酶（DUBs）是一種蛋白酶能夠從泛素化蛋白上去除泛素，從而改變許多細胞內(nèi)蛋白的構(gòu)象和功能，從而調(diào)節(jié)多種細胞內(nèi)進程和功能。在哺乳動物中，有三個與19S RP相關(guān)的去泛素化酶：Rpn11，USP14和UCH-L5。一些去泛素化酶被發(fā)現(xiàn)參與了腫瘤的進展；因此，它們正作為癌癥治療的新靶點。藤黃酸（GA），一種來自中藥藤黃的小分子，已被中國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA

3、）批準(zhǔn)進入癌癥治療的II期臨床試驗。最近，已經(jīng)報道了藤黃酸是一種新型的組織特異性蛋白酶體抑制劑，與硼替佐米具有同樣效力但更少的毒性。另一藥物金諾芬（AF），臨床上用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，最近由美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)進入癌癥治療的II期臨床試驗。與金諾芬通過抑制硫氧還蛋白還原酶增加細胞內(nèi)活性氧（ROS）誘導(dǎo)細胞凋亡的報道不同，最近的研究顯示，金諾芬誘發(fā)的細胞凋亡依賴于蛋白酶體的去泛素化酶（UCH-L5和USP14）抑制。本課題

4、研究了，在表達Bcr-Abl-T315I突變型和Bcr-Abl野生型的慢性粒細胞性白血病細胞中，藤黃酸和金諾芬對細胞存活或凋亡的影響，并進行了以下試驗：
　　第1部分藤黃酸在伊馬替尼耐藥的慢性粒細胞性白血病細胞中的抗腫瘤活性
　　1.1藤黃酸抑制Bcr-Abl野生型和突變型慢性粒細胞性白血病細胞增殖及集落形成。KBM5（ Bcr-Abl野生型）細胞是伊馬替尼敏感型細胞，而 KBM5-T315I（Bcr-Abl-T315I突變

5、）細胞是伊馬替尼耐藥型細胞。為了探討藤黃酸對慢性粒細胞性白血病細胞生長的影響，體外培養(yǎng)的KBM5，KBM5-T315I和K562細胞經(jīng)不同濃度的藤黃酸處理48小時后， MTS法檢測細胞活力。藤黃酸呈劑量依賴性降低KBM5， KBM5-T315I和K562細胞活性，IC50分別為0.32，0.35和0.40μM。為了檢驗藤黃酸對慢性粒細胞性白血病細胞的長期影響，進行了軟瓊脂集落形成實驗。用0.125至1.25μM濃度藤黃酸處理KBM5，K

6、BM5-T315I和K562細胞12或24小時。經(jīng)藤黃酸處理24小時的IC50值分別為0.24μM（KBM5細胞），0.34μM（KBM5-T315I細胞）和0.62μM（K562細胞）。
　　1.2藤黃酸誘導(dǎo)Bcr-Abl野生型和突變型慢性粒細胞性白血病細胞凋亡。接下來分析了藤黃酸誘導(dǎo)Bcr-Abl野生型和突變型細胞株細胞死亡的能力。藤黃酸處理KBM5, KBM5-T315I和K562細胞，在熒光顯微鏡下觀察PI陽性細胞或用An

7、nexin V/PI流式細胞儀檢測。在12小時的時間點, GA呈劑量依賴性引起細胞死亡。
　　1.3藤黃酸誘導(dǎo)慢性粒細胞性白血病細胞caspase的激活。Western blot結(jié)果顯示，在這三個細胞株中藤黃酸呈劑量和時間依賴性誘導(dǎo)PARP的切割。同樣的，藤黃酸處理后caspase-3，8和9蛋白的前體形式均下降，caspase-3、-8、-9的活化形式增加，表明藤黃酸通過caspase的激活引發(fā)慢性粒細胞性白血病細胞凋亡。藤黃酸

8、處理KBM5和KBM5-T315I細胞后，線粒體膜的完整性降低，在這些細胞中釋放出的細胞色素C和AIF水平升高。為進一步發(fā)現(xiàn)在這些慢性粒細胞性白血病細胞中，藤黃酸引起抗凋亡蛋白Mcl-1、XIAP、Bcl-2明顯下降。
　　1.4藤黃酸在慢性粒細胞性白血病細胞中抑制蛋白酶體功能。為了檢測藤黃酸對蛋白酶體功能的直接影響，首先研究了體外培養(yǎng)的白血病細胞中的蛋白酶體活性。發(fā)現(xiàn)藤黃酸能劑量依賴性地抑制KBM5和KBM5-T315I細胞CT

9、-like活性。此外，在KBM5，KBM5-T315I和K562細胞中，藤黃酸引起泛素化蛋白和蛋白酶體底物蛋白（IκBα、Bax、HSP70、HSP90）的聚集。這些結(jié)果證實，在這些白血病細胞中低濃度藤黃酸明顯抑制泛素-蛋白酶體功能，與其誘導(dǎo)細胞毒性作用相關(guān)。
　　1.5藤黃酸抑制Bcr-Abl蛋白和抑制其下游信號。還發(fā)現(xiàn)，在KBM5，KBM5-T315I和K562細胞中，藤黃酸降低Bcr-Abl總蛋白和磷酸化水平。進一步的研究結(jié)

10、果顯示，藤黃酸處理后也能抑制Bcr-Abl下游靶蛋白的水平。CrkL、STAT5、ERK1/2和Akt磷酸化也明顯降低，而ERK1/2和CrkL總蛋白水平變化不大；即使Akt和STAT5總蛋白有減少，但晚于其磷酸化蛋白的改變。但藤黃酸不影響B(tài)cr-Abl融合基因mRNA表達，表明藤黃酸介導(dǎo)的Bcr-Abl降低不是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平?？傊瑪?shù)據(jù)表明，藤黃酸抑制Bcr-Abl蛋白及下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　1.6 caspase-3的激活

11、是Bcr-Abl蛋白及其信號通路下調(diào)必需的。為了探討藤黃酸誘導(dǎo)Bcr-Abl降低的機制，我們研究它是否依賴caspase活化。發(fā)現(xiàn)泛caspase抑制劑z-VAD能抑制藤黃酸介導(dǎo)的Bcr-Abl蛋白及其下游蛋白下降，蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX處理后，部分恢復(fù)Bcr-Abl下游靶蛋白的水平。與硼替佐米的結(jié)果類似。同時，藤黃酸誘導(dǎo)Bcr-Abl減少能被caspase-3抑制劑z-DEVD逆轉(zhuǎn)但不能被組織蛋白酶B抑制劑CA-074Me逆轉(zhuǎn)，表明c

12、aspase-3而非溶酶體參與。這些結(jié)果表明，藤黃酸和硼替佐米誘導(dǎo)的caspase激活是Bcr-Abl及其下游的信號下調(diào)所必需的。
　　1.7藤黃酸介導(dǎo)的蛋白酶體抑制是caspase的激活和Bcr-Abl水平降低所必需的。接下來研究的是藤黃酸引起caspase介導(dǎo)的Bcr-Abl水平降低是否由蛋白酶體抑制介導(dǎo)。我們破壞了藤黃酸的碳9和碳10之間的雙鍵（GA~）來與藤黃酸作比較。GA~（0.5μm）不能抑制蛋白酶體活性、誘導(dǎo) cas

13、pase活化、細胞凋亡和Bcr-Abl及其下游蛋白水平降低。由于藤黃酸經(jīng)細胞內(nèi)CYP2E1代謝后成為具有活性的蛋白酶體抑制劑，接下來比較了有CYP2E1抑制劑DDC和沒有的情況下藤黃酸的效應(yīng)。DDC大部分恢復(fù)藤黃酸引起的PARP切割，caspase活化，Bcr-Abl蛋白水平降低，和蛋白酶體抑制。這些結(jié)果表明，藤黃酸介導(dǎo)抑制蛋白酶體后才誘導(dǎo)caspase的激活和Bcr-Abl降低。
　　1.8藤黃酸對慢性粒細胞性白血病原發(fā)性單核細

14、胞體外作用的研究。下一步評價藤黃酸對骨髓單個核細胞的體外抗腫瘤作用，五例慢性粒細胞性白血病患者（其中兩個為伊馬替尼耐藥），三名健康志愿者的外周血單個核細胞作為對照組。藤黃酸處理的原發(fā)性慢性粒細胞性白血病患者細胞活力降低，IC50值在0.58到0.82μM之間，而正常對照 IC50值超過5μM。此外，在所有五例慢性粒細胞性白血病患者單核細胞，0.25至1μM的藤黃酸處理細胞24小時后，PI或Annexin V/PI雙染法檢測出明顯的細胞凋

15、亡。藤黃酸處理后還能顯著降低Bcr-Abl、caspase3和9前體、Mcl-1的蛋白水平，引起PARP切割，引起泛素化蛋白和IκB聚集。重要的是，藤黃酸明顯抑制慢性粒細胞性白血病骨髓單個核細胞的蛋白酶體活性而在健康志愿者正常單個核細胞只有輕微的抑制。這些結(jié)果一致證實，藤黃酸對KBM5和KBM5-T315I細胞的體外抑制作用。
　　1.9藤黃酸抑制Bcr-Abl野生型和突變型裸鼠移植瘤的生長。下一步評估了體外和體內(nèi)裸鼠移植瘤模型中

16、，聯(lián)合使用藤黃酸和伊馬替尼的效應(yīng)。藤黃酸和伊馬替尼單獨能夠誘導(dǎo)Bcr-Abl磷酸化抑制和PARP切割，而藤黃酸和伊馬替尼的聯(lián)合并不能提高KBM5細胞中這些變化；在KBM5-T315I細胞，藤黃酸而不是伊馬替尼，能夠誘導(dǎo)Bcr-Abl磷酸化抑制和PARP切割。在體內(nèi)模型，KBM5和KBM5-T315I細胞接種于裸鼠皮下。然后小鼠經(jīng)腹腔注射溶劑、藤黃酸（3mg/kg/2天）、伊馬替尼（50mg/kg/天）或聯(lián)合藤黃酸和伊馬替尼處理14天。結(jié)

17、果發(fā)現(xiàn)，藤黃酸處理組可顯著抑制Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突變裸鼠移植瘤的生長；藤黃酸組腫瘤重量明顯降低，而藤黃酸和伊馬替尼并沒有明顯的協(xié)同效應(yīng)出現(xiàn)，與體外實驗結(jié)果相一致。藤黃酸處理組Bcr-Abl及其下游目標(biāo)AKT，ERK1/2和STAT5蛋白水平明顯下降，蛋白酶體靶蛋白IκBα和泛素化蛋白高度聚集。表明藤黃酸在伊馬替尼敏感型和伊馬替尼耐藥型裸鼠移植瘤中抑制蛋白酶體功能。檢測了一些增殖、分化，粘附和遷移相關(guān)的蛋白標(biāo)

18、志物，如Ki67、CD11b／C、CXCR4、MMP2。發(fā)現(xiàn)藤黃酸可以抑制Ki67、CXCR4和MMP2蛋白的水平和上調(diào)CD11b/c；而藤黃酸和伊馬替尼對這些蛋白的改變沒有明顯的協(xié)同效應(yīng)?？傊Y(jié)果表明，藤黃酸能夠抑制在體Bcr-Abl野生型及Bcr-Abl-T315I細胞移植瘤。
　　第2部分金諾芬在伊馬替尼耐藥的慢性粒細胞性白血病細胞中的抗腫瘤活性
　　2.1金諾芬誘導(dǎo)Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突

19、變型細胞毒性作用:為了探討金諾芬對慢性粒細胞性白血病細胞生長的影響，金諾芬處理KBM5和KBM5-T315I細胞后，體外培養(yǎng)48小時，用MTS法檢測細胞活力。我們發(fā)現(xiàn)金諾芬可劑量依賴性地降低KBM5和KBM5-T315I細胞的存活率，IC50值分別0.57和0.50μM。
　　接下來分析了在BCR-ABL-T315I突變和野生型細胞中，金諾芬動態(tài)引起細胞死亡情況。金諾芬處理KBM5和KBM5-T315I細胞后，通過使用臺盼藍拒染實

20、驗，記錄臺盼藍染色陽性細胞數(shù)，觀察到細胞死亡比例明顯增加。同樣，濃度梯度的金諾芬處理KBM5和KBM5-T315I細胞后，用流式細胞術(shù)檢測，金諾芬引起細胞AnnexinV/PI陽性結(jié)果顯著增加，表明金諾芬能夠誘導(dǎo)慢性粒細胞性白血病細胞凋亡。
　　2.2金諾芬在慢性粒細胞性白血病細胞中誘導(dǎo)caspase的激活:金諾芬處理KBM5和KBM5-T315I細胞，檢測凋亡相關(guān)變化。Western blot分析顯示，在這兩個慢性粒細胞性白血病

21、細胞系中，金諾芬呈劑量和時間依賴的方式引起PARP切割。同時，金諾芬處理后caspase-3，8和9的前體形式均降低，而活性形式增加，這表明金諾芬觸發(fā)caspase依賴的慢性粒細胞性白血病細胞凋亡。在金諾芬處理KBM5和KBM5-T315I細胞后，線粒體膜的完整性降低，釋放到細胞質(zhì)中的細胞色素C和AIF均升高。為進一步探討金諾芬誘導(dǎo)細胞凋亡的機制，研究了金諾芬對其他凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。在KBM5和KBM5-T315I細胞中，金諾芬引

22、起抗凋亡蛋白包括Bcl-2、survivin、XIAP的水平顯著下降，而Bcl-xL、Mcl-1、Bax的水平?jīng)]有顯著變化。
　　2.3金諾芬降低Bcr-Abl蛋白并抑制其下游信號:還發(fā)現(xiàn)，在KBM5和KBM5-T315I細胞中，金諾芬呈劑量依賴性和時間依賴性降低Bcr-Abl總蛋白和磷酸化水平。此外，金諾芬降低Bcr-Abl下游靶蛋白的水平。STAT5、ERK1/2和Akt的磷酸化均明顯減少，而ERK1/2總蛋白水平變化不大，即

23、便Akt和STAT5總蛋白呈下降趨勢。Akt和STAT5總蛋白的減小晚于其磷酸化形式的變化?？傊覀兊臄?shù)據(jù)表明，金諾芬能夠誘導(dǎo)Bcr-Abl蛋白水平下降，并抑制Bcr-Abl下游信號。
　　2.4 Bcr-Abl減少與金諾芬下調(diào)基因表達和caspase依賴的切割相關(guān):為了探討在金諾芬介導(dǎo)的Bcr-Abl蛋白水平降低的機制，我們檢測了Bcr-Abl轉(zhuǎn)錄水平表達。金諾芬處理KBM5和KBM5-T315I細胞6小時后，采用RT-qPC

24、R檢測Bcr-Abl mRNA表達。我們發(fā)現(xiàn)金諾芬可以在一定程度上降低Bcr-Abl mRNA水平。但Bcr-Abl mRNA表達減少的程度比Bcr-Abl蛋白水平降低的程度要小，這表明金諾芬誘導(dǎo)Bcr-Abl轉(zhuǎn)錄水平的抑制可能不能完全，但只能部分解釋Bcr-Abl蛋白水平的降低。通過比較去泛素化酶抑制劑金諾芬和蛋白酶體抑制劑硼替佐米對Bcr-Abl蛋白水平的影響，金諾芬和硼替佐米均能引起泛素化蛋白聚集，激活caspase和降低Bcr-

25、Abl，但金諾芬似乎在降低Bcr-Abl和p-Bcr-Abl蛋白水平方面比硼替佐米更有效，與金諾芬能下調(diào)Bcr-Abl基因的結(jié)論是一致的。
　　2.5 caspase的激活介導(dǎo)了金諾芬引起的Bcr-Abl水平降低:我們和其他人報道了，Bcr-Abl融合基因可被caspase活化后切割。觀察到泛caspase抑制劑Z-VAD-fmk可在一定程度上抑制金諾芬介導(dǎo)的細胞死亡，Bcr-Abl及其下游信號蛋白降低，但并沒有減弱泛素化蛋白的積

26、累。這些結(jié)果表明，金諾芬誘導(dǎo)caspase的激活是Bcr-Abl融合基因及其下游信號降低所必需的。
　　2.6蛋白酶體抑制但不是ROS介導(dǎo)了金諾芬引起的Bcr-Abl水平降低，caspase的激活和細胞凋亡:發(fā)現(xiàn)在KBM5和KBM5-T315I細胞中，金諾芬呈劑量和時間依賴性引起泛素化蛋白和蛋白酶體特異性底物蛋白聚集；金諾芬不改變KBM5和KBM5-T315I細胞20S蛋白酶活性。一般認為，金諾芬通過誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生引起

27、凋亡。下一步我們驗證蛋白酶體抑制和ROS在慢性粒細胞性白血病細胞中的細胞毒性作用。發(fā)現(xiàn)金諾芬確實能夠誘導(dǎo)慢性粒細胞性白血病細胞ROS的產(chǎn)生。含巰基的抗氧化劑（NAC， GEE）和非巰基-抗氧化劑（TBHQ、維生素C）都能抑制金諾芬誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生；然而，只有含巰基的抗氧化劑，而不是非巰基的抗氧化劑，可以完全阻止金諾芬誘導(dǎo)的蛋白酶體抑制、Bcr-Abl水平降低和細胞凋亡。這些證據(jù)表明，金諾芬誘導(dǎo)的蛋白酶體抑制，而不是ROS的產(chǎn)生，介導(dǎo)了

28、caspase活化和Bcr-Abl降低。
　　2.7金諾芬抑制BCR-ABL野生型和T315I突變型裸鼠移植瘤的生長:下一步評估金諾芬在裸鼠移植瘤模型中的在體抗腫瘤效應(yīng)。KBM5和KBM5-T315I細胞接種于裸鼠皮下。小鼠經(jīng)腹腔注射溶劑或金諾芬（7毫克/公斤/天）12天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金諾芬組可顯著抑制Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突變型裸鼠移植瘤的生長；腫瘤重量明顯降低。金諾芬組腫瘤中Bcr-Abl和其下游的目標(biāo)

29、包括Akt，ERK1/2和STAT5磷酸化蛋白水平以及Bcr-Abl，STAT5和Akt總蛋白明顯減少，而金諾芬組泛素化蛋白和IκBα大量聚集。Ki67蛋白的免疫組化結(jié)果提示，金諾芬抑制KBM5-T315I和KBM5移植瘤的增殖?？傊?，結(jié)果表明，金諾芬不僅能抑制Bcr-Abl野生型也能抑制伊馬替尼耐藥的Bcr-Abl-T315I突變型慢性粒細胞性白血病細胞移植瘤腫瘤的生長。
　　結(jié)論：
　　（1）藤黃酸能夠誘導(dǎo)慢性粒細胞性白

30、血病細胞凋亡和抑制細胞增殖，并能抑制伊馬替尼耐藥Bcr-Abl-T315I裸鼠移植瘤的生長。結(jié)果表明，藤黃酸誘導(dǎo)的蛋白酶體抑制是誘導(dǎo)伊馬替尼耐藥和敏感型慢性粒細胞性白血病細胞的caspase活化所必需的，而caspase活化是藤黃酸誘導(dǎo)Bcr-Abl降低和細胞凋亡所必需的。
　　（2）金諾芬能夠誘導(dǎo)Bcr-Abl野生型細胞和Bcr-Abl-T315I突變細胞凋亡并抑制伊馬替尼耐藥的Bcr-Abl-T315I在體移植瘤生長；金諾芬通