MiR-181c對(duì)耐順鉑鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　1.驗(yàn)證耐藥鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP的耐藥性。
　　2.檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP和HNE1中miR-181c表達(dá)的差異并且研究其對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。
　　3.探討miRNA影響鼻咽癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　方法：
　　1.MTT法檢測(cè)不同濃度順鉑（DDP）對(duì)兩株細(xì)胞HNE1和HNE1/DDP的增殖抑制的影響；根據(jù)24、48、72h的IC50值確定耐藥株細(xì)胞的耐藥指數(shù)；鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HN

2、E1/DDP中抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2和促凋亡蛋白Bax和Bim的蛋白表達(dá)水平則采用Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證耐藥株細(xì)胞的耐藥性。
　　2.根據(jù)課題組之前的MicroRNA（miRNA）芯片結(jié)果篩選出差異表達(dá)的miR-181c，并采用熒光定量 RT-PCR方法驗(yàn)證表達(dá)的差異。
　　3.分別將類似物miR-181c mimics、抑制劑miR-181c inhibitors轉(zhuǎn)染到表達(dá)量低的HNE1

3、/DDP和表達(dá)量較高的HNE1細(xì)胞株中，RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-181c在兩株細(xì)胞中的表達(dá)情況；MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染 miR-181c mimics和inhibitors后對(duì)兩株細(xì)胞增殖抑制的影響；集落克隆、PI單染以及Annexin V/PI雙染法檢測(cè)兩株細(xì)胞凋亡的變化。
　　4.采用Western blot方法檢測(cè)miR-181c的調(diào)控對(duì)Mcl-1基因在兩株細(xì)胞中的表達(dá)的影響；轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA,集落克隆和Ann

4、exin V/PI雙染法檢測(cè)凋亡的變化。
　　結(jié)果：
　　1.鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP相對(duì)親本細(xì)胞HNE1具有耐藥的特性
　　(1) MTT法顯示：在24、48、72h，不同濃度的DDP(2、4、8、16、32μmol·L-1)作用于鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP能夠抑制其增殖，且呈時(shí)間和濃度依賴性。
　　在24、48、72h，鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP的半數(shù)抑制率(IC50)計(jì)算后得出分別為32.15±

5、0.37、21.88±0.49、14.76±0.56μmol·L-1，鼻咽癌細(xì)胞HNE1的IC50為7.87±0.33、5.25±0.15、3.45±0.35μmol·L-1。鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP耐藥指數(shù)(RI)計(jì)算后得出為4.08、4.16、4.27。從計(jì)算得出的IC50以及RI可以看出，耐藥株細(xì)胞HNE1/DDP是符合耐藥株的條件的，耐藥株的耐藥性得以驗(yàn)證。
　　(2) Western blot和熒光定量PCR結(jié)果同時(shí)顯

6、示：在耐藥株HNE1/DDP細(xì)胞中，抗凋亡蛋白以及抗凋亡基因 MRP、Bcl-2表達(dá)升高，促凋亡蛋白和促凋亡基因Bax、Bim表達(dá)下降。
　　2.miR-181c在HNE1和HNE1/DDP中的表達(dá)具有差異
　　課題組前期的miRNA芯片結(jié)果顯示，miR-181c在兩株細(xì)胞中的表達(dá)具有差異，我們采用熒光定量RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，在HNE1中，miR-181c具有3.5倍的上調(diào)。
　　3.miR-181c的調(diào)控對(duì)鼻咽

7、癌細(xì)胞凋亡的影響
　　(1)在低表達(dá)miR-181c的HNE1/DDP細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-181c的模擬物使其表達(dá)增加，相反地，在高表達(dá)miR-181c的HNE1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-181c抑制劑使其表達(dá)減少。轉(zhuǎn)染之后，采用熒光定量RT-PCR再次檢測(cè)兩株細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果證明，miR-181c類似物可以使細(xì)胞中miR-181c的表達(dá)增加，而miR-181c抑制劑則降低miR-181c的表達(dá)。
　　(2) MTT結(jié)果顯示

8、，miR-181c抑制劑能明顯增強(qiáng)HNE1細(xì)胞耐順鉑能力，miR-181c模擬物降低 HNE1/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受力。此外，集落克隆、PI單染以及Annexin V/PI雙染法結(jié)果均顯示，miR-181c抑制劑能明顯降低順鉑作用 HNE1細(xì)胞的凋亡率，miR-181c模擬物增加了順鉑作用于HNE1/DDP細(xì)胞的凋亡率。
　　4.miR-181c通過作用于Mcl-1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響
　　(1) Western b

9、lot結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)明顯高于HNE1細(xì)胞。
　　(2) Western blot結(jié)果顯示，miR-181c抑制劑能使 HNE1細(xì)胞中 Mcl-1增加，miR-181c模擬物能使HNE1/DDP細(xì)胞中Mcl-1降低。
　　(3)將Mcl-1 siRNA、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中，western blot和qRT-PCR檢測(cè)Mcl-1表達(dá)減少，證明成功干擾了Mcl-1

10、的表達(dá)。集落克隆結(jié)果可以看出，干擾了Mcl-1的表達(dá)后能減少HNE1/DDP細(xì)胞集落的形成。此外，PI單染和Annexin V/PI雙染法結(jié)果表明，干擾Mcl-1的表達(dá)后能增加順鉑誘導(dǎo)的HNE1/DDP細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)論：
　　1.HNE1/DDP較親本細(xì)胞HNE1具有耐藥的特性。
　　2. HNE1和HNE1/DDP細(xì)胞中miR-181c的表達(dá)是不同的，降低miR-181c的表達(dá)以后可以降低HNE1細(xì)胞由順鉑誘