一種方便易用的A型肉毒毒素活性檢測方法的建立.pdf

1、肉毒毒素（BoNT）是由肉毒梭菌在厭氧的情況下，產(chǎn)生的神經(jīng)外毒素，依據(jù)毒素抗原性的不同，分A～G七個亞型，其中以A型的毒性最強，是生物毒素和化學毒物中毒性最強的物質(zhì)，引起的臨床癥狀也遠遠重于B型和E型。A型肉毒毒素現(xiàn)已被廣泛應用于眼瞼痙攣、面肌痙攣、腦癱、整容除皺、瘦腿瘦臉等神經(jīng)肌肉阻滯功能的治療，多汗癥、胃失弛緩癥等自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂的治療以及偏頭痛、慢性疼痛等感覺神經(jīng)功能的治療。
　　隨著經(jīng)濟和社會的飛速發(fā)展，人們對美容的需

2、求也越來越多。最近幾年，使用肉毒毒素美容除皺、瘦腿瘦臉的愛美女士也越來越多。目前用于市場上的品牌有國外的Botox（保妥適，美國Allergen公司）、Dysport（英國Ipsen公司）、Myobloc（美國 Elan公司）以及國內(nèi)BTXA（中國衡力）等。在我國，批準上市的用于肉毒毒素治療疾病及美容目的的，只有美國的Botox（保妥適）和中國蘭州生物制品研究所有限責任公司生產(chǎn)的衡力。Botox的治療作用有頸部肌張力障礙、嚴重的原發(fā)性腋

3、窩多汗癥、神經(jīng)源性逼尿肌過度活動、膀胱過度活動癥、斜視、瞼痙攣、慢性偏頭痛、上肢痙攣。BTXA的治療作用有眼瞼痙攣、面肌痙攣的成人患者；急性麻痹性、內(nèi)分泌肌病所引起的斜視和無法手術治療12歲以上患者的斜視；暫時性改善65歲以下的眉間紋。但在這類肉毒毒素制品的使用過程中，也出現(xiàn)了一些中毒的案例，主要由注射劑量過大、注射部位藥物不適當?shù)膹浬⒆饔靡?，不同程度的出現(xiàn)了眼瞼痙攣、視物模糊、上瞼下垂、飲水嗆咳、吞咽困難、構音障礙、發(fā)聲困難、肌力減

4、退甚至呼吸困難等癥狀。
　　當肉毒毒素作為一種商業(yè)用的生物制劑，對其活性的研究尤為重要。生物制品普遍采用質(zhì)量和活性兩種表示方法，即單位質(zhì)量的生物制品中所含有的生物學活性，反映活性組成比具體情況。本研究目的是研制一種方便易用的膠體金試紙條，基于金屬鋅的酶切反應動力學及免疫反應原理來檢測肉毒毒素的活性。檢測的原理為BoNT/A摻雜的血清樣品和特別設計的底物肽在孵育一段時間后，可將特異性底物肽酶切從而使氨基端的生物素與羧基端的組氨酸標簽

5、分離，使得標記膠體金顆粒的鏈霉親和素-底物肽復合物不能被層析試紙條的檢測線上包被的抗組氨酸標簽抗體捕獲，從而呈現(xiàn)出一個不同于BoNT/A陰性血清的結(jié)果。
　　首先我們進行了 A、B型肉毒梭菌的人工培養(yǎng)。將 A型肉毒梭菌菌種接至TPYG液體培養(yǎng)基，進行肉毒梭菌的人工增菌培養(yǎng)。在37℃的厭氧溫箱中培養(yǎng)48 h后，將獲得的新鮮培養(yǎng)液接種至1 L的TPOM培養(yǎng)基進行產(chǎn)毒培養(yǎng)。用硫酸溶液沉淀抽提，得到粗毒。然后用硫酸銨沉淀，去除核酸。最后用

6、凝膠柱和離子交換柱進行精制純化。對純化的肉毒毒素進行蛋白定量后用小鼠毒力試驗來測定毒素的生物學活性。B型肉毒梭菌的培養(yǎng)、肉毒毒素純化、定量及生物學活性鑒定同A型肉毒毒素，但沒有精制步驟。由此而得到的A、B型肉毒毒素用于摻雜模擬臨床血清樣本。
　　然后設計 A型肉毒毒素底物序列如下： N端生物素化-TRIDEANQRATKM-6×His-Tag。該底物肽包含三個部分：N端生物素標簽、A型肉毒毒素特異性底物肽序列和組氨酸標簽。其中Q-

7、R為BoNT/A特異性切割的位點。當BoNT/A對肽段發(fā)生作用時，作為肽鏈內(nèi)切酶，會引起肽鏈斷裂，從而產(chǎn)生含有不同生物標簽的肽段，從而在膠體金試紙條上呈現(xiàn)不同的顯色模式。將抗His標簽單克隆抗體、抗鏈霉親和素單克隆抗體分別作為T線和C線，膠體金包被的鏈霉親和素作為探針按常規(guī)的制備方法制成層析試紙條后，我們對T線濃度、底物肽最小劑量、毒素和底物肽在體外孵育時間進行了優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果， T線濃度為1 mg/mL；特異性底物肽的優(yōu)化劑量為1

8、 ng/μL；毒素和底物肽的體外孵育時間為12 h。此外，我們用空白對照血清、B型肉毒毒素摻雜的模擬血清和不同稀釋度的A型肉毒毒素摻雜的模擬血清對試紙條的特異性及靈敏性進行了評估。根據(jù)實驗的結(jié)果，膠體金層析試紙條的最低檢測限可達到1.3 LD50/mL，約為20 pg/mL，靈敏度與金標準的小鼠致死實驗相當，但檢測時間從4天減少到12 h。
　　本研究建立的方法樣本和試劑消耗量少，檢測流程短，操作簡便易行，更適于在基層醫(yī)療機構和資

9、源有限的偏遠地區(qū)使用。通過檢測活性肽酶的含量并優(yōu)化酶聯(lián)信號放大的反應條件，使針對有活性的A型肉毒毒素的檢測較之前實驗室使用的方法更加精確。在我國，肉毒中毒事件常集中發(fā)生在經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)，交通的不便與專業(yè)設備的欠缺給肉毒中毒的診斷和救治帶來很大的困難。該檢測方法的建立可以有力的緩解上述地區(qū)感染肉毒中毒后的誤診及漏診，提高診治率。而且通過設計毒素特異性的底物肽的思路，該方案也可擴展用于其余血清型肉毒毒素的檢測。此外，A型肉毒毒素目前被一些國