大劑量腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)細(xì)胞的作用及其可能機(jī)制.pdf

1、第一部分：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對PC-12神經(jīng)細(xì)胞活性的影響及其可能機(jī)制
　　目的：觀察外源性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）對PC-12神經(jīng)細(xì)胞的影響及可能機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)高分化的PC-12神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)胰酶溶解計(jì)數(shù)后均勻接種于96孔板并分為2組：BDNF組：分別加入125μg.L-1，250μg.L-1，500μg.L-1及1000μg.L-1BDN

2、F處理；對照組：加入相同劑量的溶劑。觀察給藥處理24h后PC-12細(xì)胞的數(shù)量變化。并以磺基羅丹明B法(sulforhodamine B，SRB)檢測PC-12細(xì)胞的存活率。另取上述細(xì)胞于給藥后24h固定，采用免疫熒光法檢測細(xì)胞泛素結(jié)合蛋白P62/SQSTM1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：1.給藥24h后神經(jīng)細(xì)胞存活率的變化：與對照組相比，125μg.L-1BDNF組，250μg.L-1BDNF組,500μg.L-1BDNF組細(xì)胞存活率無

3、明顯變化（P>0.05），1000μg.L-1BDNF組細(xì)胞存活率明顯減低（P<0.05）。2.給藥24h后細(xì)胞內(nèi)P62的變化：免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組對比，BDNF各劑量組細(xì)胞內(nèi) P62表達(dá)均減少（P<0.05），而1000μg.L-1BDNF組細(xì)胞內(nèi)P62蛋白減少最明顯。
　　結(jié)論：1000μg.L-1BDNF可致神經(jīng)細(xì)胞存活率明顯減低，可能與細(xì)胞自噬強(qiáng)度增加有關(guān)。
　　第二部分：PIK3C3 siRNA-pool抑制

4、大鼠PC-12神經(jīng)細(xì)胞P62/SQSTM1的表達(dá)
　　目的：探索可高效抑制大鼠 PC-12神經(jīng)細(xì)胞上磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PIK3C3)表達(dá)的小干擾 RNA（small interferenceRNA,siRNA）的使用劑量及作用時間，并觀察其對PC-12細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：設(shè)計(jì)并合成針對 PIK3C3的 siRNA3對(siRNA125、siRNA94

5、3、siRNA2283)及一條帶綠色熒光標(biāo)記的陰性對照 FAM-siRNA。在 Lipofectamine2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染 PC-12細(xì)胞。PC-12細(xì)胞隨機(jī)分為 Normal組,Vehicle組，Mismatch組,PIK3C3siRNA25nmol.L-1組、50nmol.L-1組、100nmol.L-1組。轉(zhuǎn)染6h后,于熒光顯微鏡下計(jì)算轉(zhuǎn)染復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率,使用 MTT法檢測轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性,采用real-time PCR法

6、測定siRNA-pool的抑制率，采用細(xì)胞免疫化學(xué)的方法檢測細(xì)胞泛素結(jié)合蛋白P62/SQSTM1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果： siRNA轉(zhuǎn)染效率可隨載體使用劑量的增加而升高。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性低,各組細(xì)胞成活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PIK3C3siRNA50nmol.L-1組、siRNA100nmol.L-1組可抑制PIK3C3的表達(dá),siRNA100nmol.L-1組干擾PC-12細(xì)胞后，PIK3C3mRNA相對表達(dá)量較低。siRNA

7、100nmol.L-1組轉(zhuǎn)染 PC-12細(xì)胞48h后，P62/SQSTM1的相對表達(dá)量升高。
　　結(jié)論：siRNA100nmol.L-1組能有效地抑制PC-12上PIK3C3mRNA的表達(dá)，且引起自噬有關(guān)蛋白P62/SQSTM1的表達(dá)升高,抑制PC-12細(xì)胞的自噬。
　　第三部分：PIK3C3siRNA通過抑制自噬的過度激活對BDNF致大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　目的：觀察預(yù)給予PIK3C3siRNA轉(zhuǎn)染PC-12

8、細(xì)胞對大劑量外源性BDNF對神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。
　　方法：將體外培養(yǎng)的PC-12細(xì)胞分為六組，分別為：Normal組（N組）,Vehicle組(V組)，Mismatch組(M組)組,BDNF組（B組），PIK3C3siRNA組（S組），BDNF+PIK3C3siRNA100nmol.L-1組（BS組）。其中B組及BS組BDNF濃度為1000μg.L-1，BS組轉(zhuǎn)染試劑PIK3C3siRNA于實(shí)驗(yàn)前24h以100n

9、mol.L-1的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再加入1000μg.L-1BDNF作用24h。通過MTT法（n=5）檢測PC-12神經(jīng)細(xì)胞活性的變化、real-time PCR法(n=3)檢測與自噬有關(guān)的P62/SQSTM1基因及LC3基因的表達(dá)、細(xì)胞免疫化學(xué)(n=4)、細(xì)胞免疫熒光(n=4)法在蛋白水平上檢測P62/SQSTM1蛋白及LC3蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：細(xì)胞活性變化:與N組比較，B組神經(jīng)細(xì)胞存活率明顯下降（P<0.01），其他各組細(xì)

10、胞存活率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與 B組相比，BS組神經(jīng)細(xì)胞活力明顯增加（P<0.01）。real-time PCR結(jié)果顯示：與N組相比,B組P62/SQSTM1mRNA相對表達(dá)量下降（P<0.01），LC3mRNA相對表達(dá)量則增高（P<0.01），S組P62/SQSTM1mRNA相對表達(dá)量增高（P<0.05），LC3mRNA相對表達(dá)量則下降（P<0.05），BS組P62/SQSTM1基因相對表達(dá)量下降（P<0.05），LC3

11、mRNA相對表達(dá)量則高于N組（P<0.01），V組與M組基因表達(dá)水平與N組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與B組相比，BS組P62/SQSTM1mRNA相對表達(dá)量增高（P<0.01），LC3mRNA相對表達(dá)量則下降（P<0.05）。細(xì)胞免疫化學(xué)與免疫熒光結(jié)果顯示：與N組相比,B組P62/SQSTM1蛋白表達(dá)減少（P<0.01），LC3蛋白表達(dá)增高（P<0.01），S組P62/SQSTM1蛋白表達(dá)增高（P<0.01），LC3蛋白表