耐百草枯A549細胞差異表達基因的篩選及轉(zhuǎn)運體基因Synaptotagmin Ⅰ在耐藥形成中的作用.pdf

1、百草枯(paraquat，PQ)是一種全球廣泛使用的高效能除草劑。其對人體具有很強的毒性，經(jīng)消化道、皮膚、呼吸道及靜脈等吸收均可造成中毒，臨床上缺乏有效的治療措施，患者死亡率高達40-80％。我國PQ的生產(chǎn)和用量均居全球首位，近年國內(nèi)PQ中毒發(fā)病呈倍數(shù)增長，防治形勢非常嚴峻。
　　PQ中毒可致全身多個臟器損傷，其中肺是受累最嚴重的靶器官，可出現(xiàn)“百草枯肺”，即早期表現(xiàn)為急性肺損傷，而后期則進展為肺間質(zhì)纖維化，是PQ中毒患者死亡的主

2、要原因。PQ在肺組織的主動攝取和蓄積被認為是其誘導(dǎo)肺損傷的重要原因。有證據(jù)表明PQ在肺組織的濃聚蓄積主要依賴于多胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，但迄今人們尚未成功分離哺乳動物的多胺轉(zhuǎn)運體。盡管近來一些研究證實膜轉(zhuǎn)運蛋白如有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(OCTs)、P糖蛋白(P-gp)及多重耐藥相關(guān)蛋白(MRPs)等也與PQ的轉(zhuǎn)運有關(guān)，然而PQ在肺組織細胞的跨膜轉(zhuǎn)運的確切機制尚不清楚。
　　近年，有研究通過對耐PQ的突變植株（牛筋草、擬南芥等）其耐藥機制的分析，獲

3、得了PQ在植物內(nèi)轉(zhuǎn)運相關(guān)的重要信息，這為研究人體PQ跨膜轉(zhuǎn)運機制提供了新思路。但迄今，尚未發(fā)現(xiàn)存在對PQ耐藥的人體細胞可用于類似研究。
　　本研究中，我們借鑒腫瘤學(xué)常用的構(gòu)建耐藥細胞模型的方法，首先，通過濃度遞增、周期暴露PQ誘導(dǎo)人肺腺癌細胞(A549)，獲得對PQ耐藥的A549細胞(A549/PQ)，并觀察了其生物學(xué)特性;其次，以基因芯片技術(shù)篩查了A549/PQ細胞與親本細胞的差異表達基因，并結(jié)合文獻篩選了5個表達明顯上調(diào)的轉(zhuǎn)運

4、體基因作為候選基因;第三，通過RT-PCR和Western blot對5個候選基因進行表達的驗證，并考察這些基因表達與PQ急性暴露的關(guān)系，最后確認一個基因SynaptotagminⅠ(SYT1)可能與A549/PQ細胞耐藥有關(guān);第四，以shRNA技術(shù)抑制A549/PQ細胞SYT1的表達，觀察SYT1沉默對A549/PQ細胞生物學(xué)特性及細胞內(nèi)PQ濃度的影響，初步確認SYT1基因在A549/PQ細胞形成耐藥中的作用與機制。
　　結(jié)果發(fā)

5、現(xiàn)，與親本細胞比，A549/PQ細胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、細胞間隙小;細胞的倍增時間明顯延長;細胞周期分析表明耐藥組G0/G1期細胞明顯增多，而S期細胞明顯減少;CCK-8檢測表明PQ暴露后A549/PQ存活率明顯高于親本細胞，其對PQ的耐藥指數(shù)7.98，為中度耐藥;LDH釋放實驗也證實PQ誘導(dǎo)的A549/PQ細胞損傷明顯輕于親本細胞;流式細胞檢測表明PQ誘導(dǎo)的A549/PQ細胞早期凋亡率低于親本細胞;HPLC法測得暴露后A549/PQ

6、細胞內(nèi)PQ濃度明顯低于親本細胞。表明A549/PQ細胞與親本細胞間存在明顯的生物學(xué)差異，且細胞內(nèi)濃度降低預(yù)示耐藥細胞可能存在拮抗PQ蓄積的機制。
　　基因芯片技術(shù)篩查表明，A549/PQ細胞與親本細胞間共有3335個差異表達基因，其中顯著上調(diào)的1555個，顯著下調(diào)的有1780個。功能涉及轉(zhuǎn)運體、胞內(nèi)蛋白代謝與修飾、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體結(jié)合、酶活性調(diào)節(jié)、細胞支架蛋白與結(jié)合等。其中，兩組間存在126個差異表達的轉(zhuǎn)運體基因（51個上調(diào)，75個

7、下調(diào)），結(jié)合文獻分析，表達上調(diào)最明顯的5個基因包括DNM1，STEAP2, CDH1，SLC7A2, SYT1等可能參與A549/PQ耐藥的形成機制。
　　RT-PCR驗證顯示A549/PQ細胞上述5個候選基因表達均明顯增強，與芯片結(jié)果一致。但給予800μmol/L的PQ暴露，不管是A549/PQ細胞還是親本細胞，其DNM1、STEAP2、CDH1、SLC7A2 mRNA表達均未能隨著PQ的暴露上調(diào)。而兩組細胞內(nèi)SYT1mRNA的

8、表達在PQ急性暴露后均出現(xiàn)明顯升高，提示SYT1可能參與了PQ誘導(dǎo)的細胞應(yīng)激過程，并在A549/PQ細胞形成耐藥中發(fā)揮重要作用。
　　利用shRNA技術(shù)沉默A549/PQ的SYT1基因，并予PQ暴露，結(jié)果干擾后的A549/PQ細胞存活率較前明顯下降， LDH釋放明顯增加，流式細胞技術(shù)及凋亡蛋白Bax/Bcl-2檢測均提示早期凋亡較前明顯增加，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)干擾后細胞在PQ暴露后皺縮明顯，胞體顏色加深，顯示損傷更明顯。此外， HPL

9、C法測得干擾后細胞內(nèi)PQ濃度較前顯著升高，且明顯高于親本細胞。進一步觀察到PQ暴露可使A549/PQ及親本細胞囊泡轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白SYT1、SNAP25、Rab26表達明顯上調(diào)，提示PQ暴露可使兩組細胞囊泡轉(zhuǎn)運加強;而SYT1基因沉默可明顯抑制A549/PQ細胞內(nèi)上述囊泡轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的表達，抑制囊泡轉(zhuǎn)運。表明，SYT1基因沉默可完全逆轉(zhuǎn)A549/PQ細胞對PQ的耐藥性，且細胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運被抑制，伴隨胞內(nèi)PQ蓄積增加。
　　根據(jù)以上研究結(jié)

10、果，我們得出如下結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了對PQ耐藥的A549細胞(A549/PQ)，其生物學(xué)特征與親本細胞存在明顯差異。暴露后A549/PQ細胞內(nèi)PQ濃度明顯低于親本細胞，提示A549/PQ細胞內(nèi)存在拮抗PQ蓄積的機制。這為PQ毒理及其跨膜轉(zhuǎn)運機制研究提供了良好的細胞模型。
　　2、A459/PQ細胞與親本細胞的基因表達存在明顯差異，差異表達基因功能涉及轉(zhuǎn)運體、胞內(nèi)蛋白代謝與修飾、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體結(jié)合、酶活性調(diào)節(jié)、細胞支架蛋

11、白與結(jié)合等，提示A549/PQ細胞對PQ耐藥是一個多基因參與的復(fù)雜過程。
　　3、A549/PQ細胞與親本細胞轉(zhuǎn)運體基因表達存在明顯差異。經(jīng)驗證SYT1在親本細胞低表達，而在A549/PQ細胞呈高表達，且兩組細胞SYT1表達在PQ急性暴露后均可進一步升高，提示SYT1可能參與PQ誘導(dǎo)的細胞應(yīng)激代償過程，并在A549/PQ細胞拮抗PQ毒性形成耐藥中發(fā)揮重要作用。
　　4、成功構(gòu)建含SYT1-RNAi的慢病毒載體，實現(xiàn)對A549

12、/PQ細胞目的基因及蛋白表達的下調(diào)，且SYT1基因沉默對A549/PQ細胞無明顯毒性作用。
　　5、SYT1基因沉默可完全消除A549/PQ細胞對PQ的耐藥性，且其對PQ毒性的敏感性更高于親本細胞，表明SYT1在A549/PQ細胞拮抗PQ毒性形成耐藥作用中起著至關(guān)重要的作用。
　　6、SYT1基因沉默明顯抑制A549/PQ細胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運，細胞內(nèi)PQ濃度因此而升高，提示SYT1調(diào)控的囊泡轉(zhuǎn)運可能參與了A549/PQ細胞PQ排出