腸桿菌科細(xì)菌替加環(huán)素耐藥機(jī)制研究.pdf

1、腸桿菌科細(xì)菌，包括肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，是當(dāng)今世界范圍內(nèi)出現(xiàn)的引起院內(nèi)感染的重要病原體。替加環(huán)素因其良好的抗菌活性和臨床使用的安全性，是目前國(guó)內(nèi)外用于應(yīng)對(duì)碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌的首選抗菌藥物。近年來(lái)隨著替加環(huán)素的廣泛使用，關(guān)于腸桿菌科細(xì)菌替加環(huán)素耐藥的報(bào)道逐年增多，尤其是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥率也呈逐年上升趨勢(shì)，而現(xiàn)有的研究并不能合理解釋腸桿菌科細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素耐藥的原因。本研究通過兩部分內(nèi)容，探討了腸桿菌科細(xì)菌對(duì)

2、替加環(huán)素耐藥的主要機(jī)制，并深入探索了腸桿菌科細(xì)菌替加環(huán)素耐藥的新機(jī)制。
　　第一部分，主要研究產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌臨床菌株對(duì)替加環(huán)素的敏感性以及探索RND型外排泵在肺炎克雷伯菌替加環(huán)素耐藥中所起的作用。我們共收集了215株產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌臨床菌株，通過微量肉湯稀釋法測(cè)定這些菌株的替加環(huán)素最低抑菌濃度(MIC);挑選替加環(huán)素耐藥菌株，使用外排泵抑制劑探討外排泵在這些菌株替加環(huán)素耐藥中所起的作用;通過熒光定量PCR檢測(cè)RND型外排

3、泵基因acrB和oqxB以及它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（ramA、marA、soxS和rarA）的表達(dá)并分析這些基因與替加環(huán)素MIC的相關(guān)性。結(jié)果顯示:215株產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌中有24株對(duì)替加環(huán)素耐藥(MIC≥4 mg/L，EUCAST標(biāo)準(zhǔn))，耐藥率為11.2％。而外排泵抑制劑NMP可有效恢復(fù)上述菌株對(duì)替加環(huán)素的敏感性（91.7％的菌株恢復(fù)敏感）。熒光定量PCR結(jié)果顯示外排泵基因acrB的表達(dá)量與替加環(huán)素的MIC呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）

4、。此外，我們還在3株耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)ramA高表達(dá)現(xiàn)象，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些菌株均存在ramR突變。對(duì)其中一株ramR突變引起基因表達(dá)終止的菌株進(jìn)行野生型ramR回補(bǔ)，回補(bǔ)后的菌株恢復(fù)對(duì)替加環(huán)素的敏感性，同時(shí)ramA和acrB的表達(dá)均受到抑制。本研究結(jié)果表明:RND型外排泵AcrAB-TolC在肺炎克雷伯菌臨床菌株替加環(huán)素耐藥中起著關(guān)鍵的作用，它的表達(dá)量和細(xì)菌替加環(huán)素MIC呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）;同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)ramR基因的突變進(jìn)而引起

5、ramA基因和外排泵AcrAB的高表達(dá)是肺炎克雷伯菌臨床菌株替加環(huán)素耐藥的主要機(jī)制之一。
　　第二部分，通過基因敲除、體外誘導(dǎo)等技術(shù)探索了大腸埃希菌替加環(huán)素耐藥的新機(jī)制。我們利用Red重組系統(tǒng)，進(jìn)行基因敲除。以標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922為親本菌株，構(gòu)建了大腸埃希菌外排泵AcrAB敲除株25922ΔacrAB，然后以ATCC25922和25922ΔacrAB為親本菌株進(jìn)行替加環(huán)素體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，獲得耐藥菌株25922Δacr

6、AB-TGC8和25922-TGC8。對(duì)耐藥菌株和親本菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，并通過比較基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法尋找突變基因，發(fā)現(xiàn)在25922ΔacrAB-TGC8和25922-TGC8中均存在mlaA基因突變，而隨后的基因敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)亦證明mlaA基因的突變可以導(dǎo)致大腸埃希菌替加環(huán)素的MIC升高8倍。進(jìn)一步研究表明，在菌株25922-TGC8中該細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素耐藥是Mla系統(tǒng)、外排泵AcrAB和核糖體蛋白變異三種機(jī)制共同作用的結(jié)果，最終使