重組人微小纖溶酶原的中試及藥效學研究.pdf

1、玻璃體后脫離(Posterior Vitreous Detachment，PVD)是糖尿病視網膜病變和視網膜靜脈阻塞的常見并發(fā)癥，老年及近視人群中也有較高的發(fā)病率。玻璃體切割、視網膜復位是有效治療手段，但手術并發(fā)癥較高，效果不夠理想。不少臨床研究表明：手術前，以少量纖溶酶降解玻璃體與視網膜連接處蛋白質，可明顯減少手術引起的視網膜出血、脫離等并發(fā)癥。 視網膜靜脈阻塞是僅次于糖尿病視網膜病變的第二大視網膜血管疾病，是導致視力喪失的主

2、要原因之一。目前的系統(tǒng)溶栓療法雖起到一定的治療效果，但易引起廣泛的出血，不宜推廣應用。且臨床使用的溶栓藥物多為纖溶酶原激活劑，需激活纖溶酶原(Plasminogen，Plg)為纖溶酶(Plasmin，Plm)后才能發(fā)揮溶栓作用。然而，由于栓塞局部的纖溶酶原無法得到及時補充，從而使溶栓效果不理想，血管再通率不高。本研究研制微小纖溶酶防治眼科疾病。 人纖溶酶是絲氨酸蛋白酶超家族的成員之一，不僅可降解血栓中的纖維蛋白，發(fā)揮溶栓作用，而

3、且還可降解細胞外基質，參與炎癥、組織重建、排卵、腫瘤細胞浸潤與轉移等多種生理、病理過程。人纖溶酶原是一種由791個氨基酸殘基構成的糖蛋白，分子量約92 kDa。在堿性條件(pH 11.0)下，纖溶酶限制性降解纖溶酶原．Arg530-Lys531位上的肽鍵，生成含261個氨基酸殘基的微小纖溶酶原(microplasminogen，μPlg)。它不包含人纖溶酶原N端多肽、五個同源的三角區(qū)(K1-K5)，但保留了纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶(SP)

4、活性區(qū)，可被纖溶酶原激活劑激活后形成微小纖溶酶，具有纖溶活性，受a2-抗纖溶酶(a2-antiplasmin，a2-AP)的抑制作用很小。 本實驗室采用蛋白質工程技術構建了含人纖溶酶原546-791位間246個氨基酸殘基的重組人微小纖溶酶原(recombinant human microplasminogen，rh—μPlg)編碼序列的表達質粒，轉化甲醇營養(yǎng)型壁赤酵母GS115，獲得了rh—uPlg高效分泌性表達。本研究在已獲得

5、rh-μPlg高效表達菌的基礎上，建立了快速、簡便、高效的中試工藝。采用7.5 L發(fā)酵罐，工程菌密度OD600在200以上，發(fā)酵液經超濾、凝膠過濾和離子交換層析三步純化，可獲得純度為95％以上的rh-μPlg，產率達200 mg/L培液。還原性SDS-PAGE顯示rh-μPlg表觀分子量為32 kDa，質譜測定其分子量為27 787 Dalton，等電點為pH 7.5-7.8。經尿激酶激活后，以三肽底物S2390(NH2-D-Val-P

6、he-Lys-p-nitroanilide)測定比活性為23.6 U/mg，Kcat/Km為127.8740±0.01 mM-1s-1，而人血漿提取的纖溶酶原的比活性、Kcat/Km分別18.2 U/mg．94.15+0.03 mM-1s-1。將得到的rh-uPlg純品在體外與重組人組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)以摩爾比200：1比例混合，37℃孵育40分鐘，注入于兔眼玻璃體腔后部，分別在注藥后1天、7天，以掃描電鏡、大體檢查、眼部

7、B超及相干光斷層掃描(OCT)檢測完全性玻璃體后脫離的發(fā)生。結果表明：玻璃體腔注入0.5、1.0、1.5 U微小纖溶酶后1天，可分別誘導25％、75％、82.5％的兔眼后極部、赤道部玻璃體皮質完全性脫離：玻璃體注入1.0 U纖溶酶后1天，可誘導66.7％兔眼完全性玻璃體后脫離。各注藥眼在治療后1天，其視網膜電圖a波、b波振幅都出現(xiàn)了顯著下降，3天、7天時逐漸恢復，至第7天與對照組無顯著差別；而a波、b波的延遲期與對照組皆無顯著差異。HE

8、染色顯示各注藥眼的視網膜內層細胞結構完整，與對照眼無明顯差別。 SD大鼠實驗研究顯示了同樣的結果。免疫熒光組織化學檢測顯示：SD大鼠對照眼玻璃體視網膜界面纖連蛋白(FN)主要分布于內界膜與玻璃體后皮質的錨合位點，層粘連蛋白(LN)除分布于錨合位點以外，還均一分布于內界膜的致密板或透明板。在微小纖溶酶誘導的完全性玻璃體后脫離大鼠眼中，玻璃體與視網膜間錨合位點處的FN、LN被降解，而致密板或透明板中的LN無明顯降解。表明：微小纖溶酶

9、對SD大鼠玻璃體與視網膜間錨合位點FN、LN的降解誘導完全性玻璃體后脫離。 玻璃體內注射微小纖溶酶溶栓尚能有效治療視網膜靜脈阻塞。用光化學法建立SD大鼠視網膜靜脈阻塞模型。激光照射后1小時，眼底觀察及視網膜血管造影皆顯示視網膜靜脈血流中斷。造模后1天，組織化學檢測證實阻塞部位有血栓形成，周邊組織排列紊亂，透射電鏡顯示雙極細胞、神經節(jié)細胞皆發(fā)生了自溶。對造模成功的大鼠，玻璃體內注射0.04 U微小纖溶酶，7天后視網膜血管造影顯示血