神經肽Y對大鼠骨髓間充質干細胞增殖和凋亡的影響及與Wnt-β-catenin信號通路相關性研究.pdf

1、多種原因造成的骨折、骨延遲愈合和骨不愈合等是目前創(chuàng)傷骨科臨床常見疾病，其治療始終是骨科領域研究的難點和熱點問題。骨折愈合包含著機體各系統(tǒng)、多種組織、細胞因子之間錯綜復雜的協(xié)同作用。近年來越來越多文獻證實神經肽Y(Neuropeptide Y，NPY)在此過程中扮演著重要角色，通過多種途徑影響骨組織的發(fā)育、形成及代謝。
　　神經肽Y是含量最豐富的神經肽之一，廣泛分布于哺乳動物中樞和外周神經系統(tǒng)，由36個氨基酸殘基組成的多肽。神經肽Y

2、表現出非常重要但仍很少了解的調節(jié)信號功能，神經肽Y主要通過作用于五種G蛋白偶聯受體(Y1，Y2，Y4，Y5和Y6)發(fā)揮其生物學作用，其中Y1、Y2受體與成骨細胞的誘導分化、增殖等密切相關，但對骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)的增殖和凋亡的作用并不清楚且作用機制不明確。已有文獻證實Wnt/β-catenin信號通路在骨形成、重建及修復等過程中起著極為重要的作用，激活Wnt/β-cateni

3、n信號通路可促進成骨細胞的增殖和改善細胞存活。因此，進一步研究了解神經肽Y對骨髓間充質干細胞的增殖和凋亡的影響，以及在此過程中Wnt/β-catenin信號通路的作用，有助于明確神經肽在骨代謝過程中的作用機理。
　　本研究通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取SD大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)，培養(yǎng)至第三代，采用流式鑒定法鑒定其純度，以高純度的BMSCs為研究對象，將細胞分為六組，對照組（加入等量PBS），NPY（10-12mol/L）組，

4、NPY(10-10mol/L)組，NPY(10-8mol/L)組，NPY（最佳效應濃度）+NPYY1受體拮抗劑組PD160170（1μM）組以及NPY（最佳效應濃度）+Wnt通路拮抗劑DKK1（0.2μg/mL）組，對于NPY對BMCs增殖影響研究部分，細胞采用完全培養(yǎng)基（10％胎牛血清及體積分數1％青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基）進行培養(yǎng)1，3，5,7天，而對于NPY對BMCs凋亡影響研究部分，細胞采用去血清培養(yǎng)基（體積分數1％青鏈霉

5、素混合液的DMEM培養(yǎng)基）進行培養(yǎng)12h或24h，通過Brdu細胞增殖試驗和CCK-8試驗檢測細胞增殖和凋亡情況、細胞流式技術檢測細胞增殖周期和凋亡情況，q-PCR和Western blot檢測增殖、凋亡相關基因和蛋白表達以及Wnt/β-catenin信號通路相關基因和蛋白表達。
　　結果提示NPY可促進BMSCs的增殖，并呈現出時間-濃度依賴性，最大效應濃度為10-10M，以NPY刺激后5，7天更為明顯。此外，NPY顯著提高細胞

6、S和G2/M期的百分比，可提高Cyclin D1mRNA的表達并降低P53mRNA的表達。NPY可明顯降低BMSCs去血清培養(yǎng)24h后的細胞凋亡，顯示出保護作用，以10-12M濃度最為明顯;同時細胞流式結果提示NPY可明顯降低BMSCs去血清培養(yǎng)24后細胞早期和中期凋亡率，q-PCR提示NPY可明顯降低凋亡基因caspase-3、caspase-9和Bax的mRNA表達水平。對Wnt/β-catenin信號通路相關基因和蛋白表達發(fā)現，在

7、完全培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)下第3，5，7天后，10-10M NPY可明顯促進C-myc、β-catenin mNRA和C-myc、β-catenin、p-GSK-3β蛋白的表達，同時在去血清凋亡24h后，NPY可明顯促進C-myc、β-catenin、p-GSK-3β蛋白的表達，NPY的增殖和抗凋亡作用被Y1受體拮抗劑PD160170或Wnt通路拮抗劑DKK1部分阻斷，且可同時部分阻斷NPY對β-catenin，p-GSK-3β和c-myc的m