日本斑點(diǎn)熱立克次體近緣株OmpB重組蛋白抗原性研究.pdf

1、【研究背景】
　　斑點(diǎn)熱群立克次體被認(rèn)為是一類分布廣、危害大由蜱傳播的人獸共患疾病。如由康氏立克次體引起的地中海斑點(diǎn)熱，由立氏立克次體引起的落基山斑點(diǎn)熱。斑點(diǎn)熱的臨床癥狀與普通的感冒相似，往往伴隨著高燒，各種疼痛，惡心和嘔吐，往往伴隨皮疹，嚴(yán)重的患者時候可能出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀。
　　日本斑點(diǎn)熱立克次體是日本科學(xué)家1984年發(fā)現(xiàn)的。1984年，5月到7月間，日本醫(yī)生發(fā)現(xiàn)了三例患高熱和皮疹的人，且三人都住在同一個鄉(xiāng)村，在同一

2、座山上的竹林里采集竹筍。其中兩例具有焦痂，進(jìn)行仔細(xì)觀察分析，并通過一系列的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)證明并非是恙蟲病而是一種斑點(diǎn)熱群立克次體，這種病被稱為日本斑疹熱。病原體是1985年首先從日本的四國島地區(qū)分離出來，因其作為一種新的斑點(diǎn)熱群立克次體，隨后被命名為Rickettsia japonica。
　　2000年前，我國關(guān)于斑點(diǎn)熱立克次體研究主要在東北地區(qū)，證明不同的嚙齒類動物攜帶黑龍江斑點(diǎn)熱立克次體、西伯利亞斑點(diǎn)熱立克次體和內(nèi)蒙古斑點(diǎn)熱立克

3、次體3種病原體，同時也從患者血液中分離到黑龍江斑點(diǎn)熱立克次體菌株。2000年后的十幾年間，我國很少有相關(guān)斑點(diǎn)熱立克次體病原學(xué)研究的報道。2013年我們團(tuán)隊(duì)在安徽省大別山區(qū)高熱、頭痛、全身斑丘疹的病人急性期血液標(biāo)本中分離到一株日本斑點(diǎn)熱立克次體近緣株，安徽120株（R.Japonica Anhui120 strain），簡稱安徽120株，這是首次在我國發(fā)現(xiàn)的人感染日本斑點(diǎn)熱立克次體。
　　文獻(xiàn)報道，斑點(diǎn)熱立克次體體外培養(yǎng)在Vero細(xì)

4、胞和L929細(xì)胞均能良好生長，但是我們團(tuán)隊(duì)分離到的這株菌不能在 Vero和 L929細(xì)胞中大量增殖，反而可在THP-1細(xì)胞（巨噬樣細(xì)胞）中大量增殖。通過對這株菌的ompA、ompB、geneD、16SrRNA、17kD基因進(jìn)行測序分析可知，OmpB基因擴(kuò)增的基因片段在3170bp和3204bp發(fā)現(xiàn)存在2個單個堿基突變，在3297~3311處與日本斑點(diǎn)熱立克次體株比較有連續(xù)15堿基的缺失。而OmpB基因是日本斑點(diǎn)熱立克次體菌的外膜蛋白，與

5、細(xì)菌結(jié)合、入侵宿主細(xì)胞有關(guān)，因此我們考慮我們分離株的細(xì)胞嗜性可能與OmpB基因連續(xù)15個堿基的缺失有關(guān)。因此，本文通過構(gòu)建OmpB原核表達(dá)質(zhì)粒、重組蛋白表達(dá)、純化以及抗原性的相關(guān)研究方面，為立克次體致病機(jī)制研究進(jìn)行了一些基礎(chǔ)的研究。
　　【研究方法】
　　（1）日本斑點(diǎn)熱立克次體近緣株全菌多克隆抗體的制備:由本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種去感染正常的THP-1細(xì)胞，待菌體在油鏡下用Diff-Quick染色觀察在細(xì)胞內(nèi)的感染率約為100%

6、時，取培養(yǎng)物去注射4只新西蘭大白兔，共注射四次，每周一次，結(jié)束后采集兔心臟血，無菌分裝后，保存于-80℃冰箱。
　?。?）OmpB重組蛋白表達(dá)與純化：將OmpB基因中特殊的一段通過T4連接酶連接至 PET-30a載體后，用 IPTG誘導(dǎo)這段 OmpB基因的表達(dá)，利用 SDS-page和Western-blot（WB）對重組蛋白OmpB的反應(yīng)原性進(jìn)行鑒定，然后分別通過親和層析技術(shù)和變復(fù)性技術(shù)對重組蛋白OmpB上清形式和包涵體形式進(jìn)行

7、純化。
　?。?）間接ELISA體系的建立：利用棋盤滴定法，依次確定抗原的最佳包被濃度，最佳血清稀釋濃度以及最佳酶標(biāo)二抗?jié)舛?，并與已有的國際上標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法（美國 Focus公司立克次體 IgG免疫熒光試劑盒，產(chǎn)品編號為：IF0100MG)對比分析判斷該方法的特異性，敏感性，符合率，Kappa值。
　　【研究結(jié)果】
　　(1)通過免疫新西蘭大白兔，取得心臟血后無菌分裝制備成日本斑點(diǎn)熱立克次體多克隆抗體，IF測得結(jié)果為強(qiáng)

8、陽性；間接ELISA方法測得兔多克隆抗體的效價為1:8000；
　　(2)通過酶切和測序，成功的構(gòu)建含OmpB基因片段的重組質(zhì)粒，純化后用lowey法測得用載體PET-30a構(gòu)建的重組蛋白濃度為4mg/ml。
　　(3)成功的建立了OmpB重組蛋白間接 ELISA方法的體系，并且該方法具有良好的特異性和敏感性，與與已有的國際上標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法（美國Focus公司立克次體IgG免疫熒光試劑盒，產(chǎn)品編號為：IF0100MG)相比，