周期蛋白Cyc28在嗜熱四膜蟲中的功能分析.pdf

1、真核生物的細胞周期通過連續(xù)激活和失活特定的周期蛋白/周期蛋白依賴性激酶復合物活性進行調控。在哺乳動物細胞周期中，周期蛋白A和周期蛋白B通過泛素化降解途徑使靶蛋白去磷酸化，促進有絲分裂中期向后期轉化；周期蛋白D通過磷酸化Rb蛋白終止G1期，促進細胞G1/S期轉化。
　　不同的生物體包含的周期蛋白類型不同，單細胞真核生物纖毛蟲表現出周期蛋白多樣性，表明單細胞生物體內存在精細的調控機制。嗜熱四膜蟲含有1個小核和1個大核，小核為二倍體，在

2、營養(yǎng)生長期轉錄沉默，大核為多倍體，轉錄活躍，營養(yǎng)充足時細胞進行無性生殖，饑餓條件下進行有性生殖。有性生殖過程中，小核進行減數分裂，產生4個原核，其中3個降解，另外1個原核進行有絲分裂產生配子核，配子核交換，融合產生合子核。合子核通過有絲分裂產生新的大核和新小核，完成有性生殖。嗜熱四膜蟲含有34種周期蛋白，其中Cyc2, Cyc17和Cyc28在四膜蟲小核減數分裂期特異表達，Cyc2調控了小核減數分裂的起始，而Cyc17對減數分裂后期的起

3、始和同源染色體的分離是必需的，但是Cyc28的功能目前并不清楚。
　　本研究首次從嗜熱四膜蟲鑒定了有性生殖特異表達的周期蛋白基因CYC28，對其功能進行了分析，主要結果如下：
　　1. CYC28生物信息學分析基于四膜蟲大核基因組數據庫（http//:www.ciliate.org）和功能基因組數據庫(http://tfgd.ihb.ac.cn）分析表明嗜熱四膜蟲 CYC28（TTHERM_00082190）基因全長1174

4、 bp，開放閱讀框801 bp，預測編碼266個氨基酸。RT-PCR產物測序分析表明CYC28序列正確。序列比對分析N端有一個由121個氨基酸組成的保守性周期蛋白框，周期蛋白框后有一個由9個氨基酸殘基組成的破壞框。周期蛋白框同源序列分析表明Cyc28可能屬于周期蛋白B3亞家族。Microarray表達譜和實時熒光定量檢測結果表明CYC28在營養(yǎng)生殖期和饑餓期不表達，在有性生殖期特異表達，4 h時表達量最高。
　　2. HA-Cyc

5、28的細胞定位及表達分析為研究Cyc28的功能，構建帶有HA標簽的表達載體 pXS75-CYC28，該表達載體由MTT1啟動子調控，在Cd2+誘導下高效表達，經基因槍轉化，巴龍霉素濃度梯度篩選，選擇穩(wěn)定的細胞株。免疫熒光定位表明，Cyc28在有性生殖早期定位于細胞質，在8 h定位在凋亡的舊大核上，表明Cyc28可能通過泛素化途徑，在凋亡的親本大核中降解或者直接參與了親本大核的凋亡。蛋白免疫印跡結果表明，HA-Cyc28在四膜蟲有性生殖0

6、 h沒有表達，2 h后表達上調，在4h和8h蛋白條帶變弱，可能部分發(fā)生泛素化降解，在16h配對分開后蛋白質消失。
　　3.敲減CYC28對有性生殖進程無顯著影響 CYC28是有性生殖期特異表達的基因，為進一步分析Cyc28在嗜熱四膜蟲有性生殖過程中的功能，我們首先構建了CYC28的敲除載體pNeo4-Δ-CYC28，轉化不同交配型的四膜蟲細胞，通過同源重組，篩選得到CYC28敲減細胞株。同野生型細胞相比，敲減株在有性生殖過程中，細

7、胞配對，小核拉伸，小核減數分裂以及原核選擇，合子核的有絲分裂都未見異常。由于未能獲得CYC28完全敲除的突變體細胞株，進一步構建了CYC28的干擾質粒pCYC28hpCYH，該質粒由Cd2+調控表達。干擾質粒通過基因槍轉化四膜蟲，經放線菌酮抗性梯度篩選，獲得不同交配型的突變體細胞株。qRT-PCR檢測得到穩(wěn)定的干擾株。觀察四膜蟲在有性生殖過程中核發(fā)育，結果表明小核發(fā)育過程未受影響，細胞配對，小核拉伸，減數分裂，配子核交換，新大核形成以及

8、結合后的個體均正常，表明Cyc28的敲減對有性生殖的進程無顯著影響。
　　4.過表達Cyc28影響有性生殖期原核的有絲分裂在突變體細胞OE-CYC28-B和OE-CYC28-C配對后，CYC28基因的轉錄水平比野生型提高約10倍，觀察有性生殖過程，過表達Cyc28引起原核有絲分裂進程的異常。同野生型相比，在有性生殖3.5h，45.5％細胞第一次減數分裂后期出現濃縮的染色體，未見染色體解聚后的小核；在4h，36.5%的細胞停留在第一

9、次減數分裂后期，31.5%細胞進行的第二次減數分裂，小核松散；而在6h，大多數細胞選出的小核無法進行有絲分裂；在8h，45.3%細胞中未出現新大核，在12 h，未出現發(fā)育完成的兩個大核一個小核的細胞。過量的外源Cyc28導致細胞核發(fā)育異常，原核有絲分裂受阻，有性生殖未能完成。
　　本研究首次鑒定了嗜熱四膜蟲周期蛋白基因CYC28，實時熒光定量PCR表明CYC28在有性生殖期特異表達。敲減CYC28不影響細胞的發(fā)育，而過表達CYC2