棉鈴蟲離子型受體的基因克隆、表達(dá)定位及功能研究.pdf

1、昆蟲主要依賴靈敏的嗅覺系統(tǒng)識別環(huán)境中的各種化學(xué)物質(zhì)，這些化學(xué)信號經(jīng)進(jìn)一步加工整合最終引發(fā)特定的行為反應(yīng)，如定位寄主植物、選擇產(chǎn)卵場所等。在嗅覺識別過程中，多種化學(xué)感受相關(guān)蛋白參與到其中。隨著棉鈴蟲觸角轉(zhuǎn)錄組和基因組的測序完成，多種嗅覺感受相關(guān)的蛋白相繼被鑒定。目前，對于棉鈴蟲嗅覺相關(guān)蛋白的研究主要集中在氣味受體和氣味結(jié)合蛋白上，而離子型受體作為另一類嗅覺受體，其功能尚未被揭示。本研究在棉鈴蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測序和分析的基礎(chǔ)上，克隆了6個(gè)離子型

2、受體基因并分析了它們的序列結(jié)構(gòu)，對HarmIR8a和HarmIR25a在觸角中的表達(dá)位置進(jìn)行了定位研究，記錄了棉鈴蟲腔錐形感器神經(jīng)元的功能，并對離子型受體的體外功能進(jìn)行了初步鑒定。為深入研究棉鈴蟲化學(xué)識別機(jī)制、尋找新的防治靶標(biāo)以及發(fā)展綠色行為調(diào)控劑提供了一定的分子基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.利用PCR和RACE技術(shù)，克隆了6棉鈴蟲離子型受體全長序列，包括HarmIR8a,HarmIR25a，HarmIR21a,HarmIR41a

3、,HarmIR76b和HarmIR64a。
　　2.利用生物信息學(xué)方法對上述6個(gè)棉鈴蟲離子型受體氨基酸序列、跨膜結(jié)構(gòu)域及保守功能域等進(jìn)行了分析。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，HarmIR8a和HarmIR25a與其它昆蟲種群對應(yīng)氨基酸的相似度較高，相對保守;而HarmIR21a，HarmIR41a，HarmIR76b和HarmIR64a與其它種群相比保守性相對較低。對HarmIR8a和HarmIR25a蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，其均含有一個(gè)

4、N端的氨基酸末端區(qū)域(ATD)，跨膜域(M1，M2和M3)，一個(gè)離子通道(P)，一個(gè)由S1和S2組成的配體結(jié)合域和一個(gè)胞內(nèi)C端。
　　3.利用熒光定量qPCR技術(shù)檢測了HarmIR8a，HarmIR25a,HarmIR76b,HarmIR21a，HarmIR41a和HarmIR64a分別在棉鈴蟲雌雄成蟲8個(gè)組織中的相對表達(dá)量。結(jié)果表明HarmIR8a在棉鈴蟲雌雄蟲的頭部、觸角等組織中均有表達(dá)，而且在雌雄蟲觸角中高表達(dá);HarmIR

5、25a在雌、雄蟲觸角中表達(dá)量最高，在其它組織中表達(dá)量較低。HarmIR76b除觸角中高表達(dá)外，在喙等部位表達(dá)量也較高;HarmIR64a在所有組織中均有表達(dá)，其中在觸角等中表達(dá)量相對較高;同時(shí)HarmIR21a和HarmIR41a均在觸角中高表達(dá)。
　　4.利用原位雜交技術(shù)初步明確了HarmIR8a和HarmIR25a在棉鈴蟲觸角感受器中的表達(dá)定位。結(jié)果表明2個(gè)離子型受體主要在棉鈴蟲觸角的腔錐形感器下表達(dá)，在其它感器（毛形感器、錐

6、形感器、刺形感器等）中未檢測到雜交信號。
　　5.利用單細(xì)胞記錄技術(shù)，對棉鈴蟲觸角腔錐形感器的神經(jīng)元功能進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，經(jīng)記錄的腔錐形感器神經(jīng)元對酸類、胺類、醛類及酯類等氣味物質(zhì)均有電生理反應(yīng)，但是對兩種萜烯類化合物（檸檬烯和α-蒎烯）均沒有電生理反應(yīng)。同時(shí)將棉鈴蟲觸角腔錐形感器劃分為4個(gè)功能亞型，包括TypeA，Type B，Type C和TypeD型，每個(gè)亞型中神經(jīng)元的功能有一定的分化。
　　6.利用爪蟾卵母細(xì)胞結(jié)