高糖刺激大鼠系膜細胞氧化應激和炎癥反應對Ⅳ型膠原生成的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病全身性微小血管病變的腎臟特征性表現(xiàn)，是糖尿病患者的主要死亡原因之一，也是引起終末腎病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因之一。其基本的病理改變是系膜細胞的增生及細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)成分產(chǎn)生增加。DN發(fā)病機制復雜，目前尚未明確，然而，氧化應激和炎癥損傷被廣泛認為是DN的重要機制，也被我們的

2、前期實驗所證實。
　　氧化應激己被認為是DN發(fā)生發(fā)展的共同通路。盡管內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)合成的一氧化氮(nitric oxide，NO)，有保護腎臟的作用。但DM時，誘導型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)合成過量的NO與O2-?？裳杆侔l(fā)生反應生成過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite，ONOO-

3、)，導致廣泛的氧化應激損傷，參與DN的發(fā)病與進展。而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)轉基因通過減少ONOO-的生成，起到防治DN的作用。我們的前期研究也表明iNOS選擇性抑制劑氨基胍和ONOO-清除劑尿酸鹽(Urate)可顯著延緩DN的發(fā)生與進展，提示氧化應激是DN發(fā)生的關鍵。
　　炎癥反應同樣在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。作為主要炎癥介質(zhì)的PGE2的合成主要受環(huán)氧化酶(cyclooxygenas

4、e，COX)的調(diào)節(jié)。COX-1基因具有調(diào)節(jié)機體生理平衡，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。COX-2基因在炎癥刺激和其它類型組織損傷時可被誘導，表達明顯增加。我們前期的研究表明，COX-2與iNOS共同促進了DN的發(fā)生發(fā)展。前列環(huán)素(Prostacyclin，PGI2)可拮抗PGE2等的致炎效應，而PGI2生成的關鍵酶前列環(huán)素合酶(prostacyclin synthase，PGIS)，在炎癥反應中起著重要的平衡作用。
　　亦有研究表明，內(nèi)皮

5、功能異常在糖尿病血管病變的發(fā)病中也起到關鍵作用。內(nèi)皮細胞損傷參與了DN發(fā)生發(fā)展的全過程。絕大多數(shù)內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是由腎小球的血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生和釋放的，在腎臟具有廣泛的生物活性。ET是目前所知的最強的長效縮血管活性肽，能產(chǎn)生持續(xù)的縮血管效應，在與血管病變有關疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。ET的活性受內(nèi)皮素轉化酶(endothelin converting enzyme，ECE)調(diào)節(jié)，DM時ECE活性的上調(diào)可

6、導致ET升高。
　　在DM時，氧化應激、炎癥反應、腎素.血管緊張素系統(tǒng)活性增加等共同參與DN的發(fā)生發(fā)展，他們可通過參與轉化生長因子-β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)途徑的調(diào)節(jié)，導致ECM積聚及腎小球硬化。TGF-β1主要通過Smad2、Smad3和Smad4蛋白傳遞信號，啟動腎小球基質(zhì)的主要成份Ⅳ型膠原基因轉錄。Ⅳ型膠原分子由3條α肽鏈組成，目前分離得到的單肽鏈依其一級結構不同，可分為α1(

7、Ⅳ)型膠原鏈[簡寫為α1(Ⅳ)]和α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)、α6(Ⅳ)六條。Ⅳ型膠原大分子α鏈有特定的組織分布。DN時，TGF-β1通路主要經(jīng)由Smad3激活Ⅳ型膠原基因轉錄，而Smad3敲除，可使糖尿病小鼠腎皮質(zhì)Ⅳ型膠原的α1鏈不表達。
　　雖然已有研究表明，高糖刺激早期即可引起氧化應激、炎癥反應等的損傷性反應，但是在大鼠系膜細胞中，相關酶譜的變化，尚未有報道。而高糖刺激大鼠系膜細胞所引起的早期反應，是否可

8、激活的TGF-β通路，從而導致Ⅳ型膠原的大量生成，尚未有系統(tǒng)研究。
　　本實驗采用高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，在不同時間點收集細胞，采用RT-PCR的方法檢測早期氧化應激關鍵酶eNOS、iNOS、SOD，炎癥關鍵酶COX-1、COX-2和PGIS及ECE的表達譜，以探討高糖刺激早期，相關酶譜的表達變化；RT-PCR檢測高糖誘導不同時間點，大鼠腎小球系膜細胞TGF-β1的表達，同時利用免疫熒光染色法動態(tài)觀察大鼠腎小球系膜細胞中Sma

9、d3的核轉位情況，旨在探討高糖誘導早期反應激活TGF-β/Smads信號通路的情況；RT-PCR檢測高糖誘導，大鼠腎小球系膜細胞TGF-β1下游基因Ⅳ型膠原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)各鏈的表達，旨在探討在高糖環(huán)境下，TGF-β1通路激活Ⅳ型膠原基因各α鏈的表達情況。
　　方法：
　　1培養(yǎng)細胞
　　傳代培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞接種于六孔板，10％胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)24小時，細胞換液

10、，無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24小時，使細胞同步化，細胞換液，10％胎牛血清高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。在高糖DMEM培養(yǎng)的不同時間點，終止培養(yǎng)，用于檢測。
　　2總RNA的提取：Trizol法提取細胞總RNA。
　　3 RT-PCR檢測：采用RT-PCR的方法檢測氧化應激關鍵酶eNOS、iNOS、SOD，炎癥關鍵酶COX-1、COX-2、PGIS，ECE、細胞因子TGF-β1及其下游基因Ⅳ型膠原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α

11、4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)各鏈的表達。
　　4免疫熒光染色法觀察Smad3的核轉位。
　　結果：
　　1氧化應激相關的關鍵酶iNOS的表達在高糖刺激1小時時明顯升高；eNOS表達量無變化；SOD的表達在刺激后明顯降低。
　　2炎癥反應相關的關鍵酶COX-2在高糖刺激0-3小時內(nèi)呈表達量逐漸升高的趨勢；COX-1、PGIS表達量無變化。
　　3在0-3小時內(nèi)，ECE mRNA隨刺激時間的延長，表達量逐漸增強。

12、>　　4 TGF-β1的表達具有時間依賴性，3小時開始明顯增強，有顯著統(tǒng)計學差異。
　　5 Smad3在高糖刺激80分鐘開始有進核跡象，一直持續(xù)至180分鐘。
　　6Ⅳ型膠原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α5(Ⅳ)鏈mRNA表達，在6小時時表達量達到高峰，延長至48小時其變化不大；α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)鏈mRNA無明顯表達。
　　結論：
　　1高糖刺激大鼠系膜細胞早期(0-3h)，氧化應激關鍵酶iNOS、炎癥反應關鍵酶