分子改造方法提高大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定性的研究.pdf

1、酶具有反應(yīng)活性高、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域。但是它自身穩(wěn)定性差和來(lái)源有限等缺點(diǎn)，限制了它進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和利用，所以需對(duì)天然酶分子改造，以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。目前通過(guò)分子改造來(lái)改善酶的性質(zhì)是生物技術(shù)研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向。
　　 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶是一類廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶，在氮代謝中起到非常重要的作用。它可催化轉(zhuǎn)化底物苯丙酮酸生產(chǎn)重要的醫(yī)藥、食品工業(yè)原料-L-苯丙氨酸。在生產(chǎn)L-苯丙氨酸的工藝中

2、，如能提高反應(yīng)溫度，則可增加底物苯丙酮酸的溶解度、加快草酰乙酸的分解進(jìn)而顯著提高L.苯丙氨酸的得率。而天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶無(wú)法在較高溫度的條件下反應(yīng)，是當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)L-苯丙氨酸的瓶頸之一。
　　 大腸桿菌和嗜熱菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)比較顯示了兩者在酶分子表面、酶亞基之間和酶整體結(jié)構(gòu)上的明顯差異。本文從上述三個(gè)方面的結(jié)構(gòu)差異與酶熱穩(wěn)定性間的關(guān)聯(lián)出發(fā)，分別建立了合理設(shè)計(jì)方法，半合理設(shè)計(jì)方法和定向進(jìn)化方法對(duì)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶分子進(jìn)行改造，獲得了

3、5種耐熱性提高的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，初步建立了酶分子改造的技術(shù)平臺(tái)。本文的主要內(nèi)容包括3個(gè)方面。
　　 (1)采用合理設(shè)計(jì)方法改造天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶
　　 本文分析了大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶表面loop環(huán)上氨基酸組成的特點(diǎn)，比較了大腸桿菌和嗜熱菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的組成，選擇了酶分子表面的疏水氨基酸L233和F350進(jìn)行L233N和F350K的定點(diǎn)突變。在55℃條件下初始酶的半衰期為140min，疏水氨基酸L233替換成親水氨基酸N2

4、33后，形成的突變酶Enz N233的半衰期則延長(zhǎng)至180min，疏水氨基酸F350替換成親水氨基酸K350后，形成的突變酶Enz K350的半衰期則降低至30min。這些研究工作采用突變大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶分子表面loop環(huán)上疏水氨基酸的方法，從而建立起一種獲得熱穩(wěn)定性AspAT的簡(jiǎn)易方法。
　　 (2)采用半合理設(shè)計(jì)改造天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶
　　 分析了天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶亞基的結(jié)構(gòu)、亞基間的相互作用與酶熱穩(wěn)定性的關(guān)系，選擇了

5、位于亞基之間的殘基--19、T10、A12、R282、S285和Q286作為隨機(jī)突變的位點(diǎn)，構(gòu)建了天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因突變庫(kù)。從構(gòu)建的突變文庫(kù)4000株突變菌中獲得了4種耐熱性明顯提高的突變酶(C1、C2、C3和C4)。這些突變酶在55℃條件下的半衰期都在840min以上，其中一種突變酶在37℃下的催化活性為野生型酶的87.9％。這些研究工作將合理設(shè)計(jì)方法和分子定向進(jìn)化方法結(jié)合起來(lái)，從而建立起一種增強(qiáng)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶亞基間作用力來(lái)提高酶熱

6、穩(wěn)定性的方法。
　　 (3)采用定向進(jìn)化改造天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶分子的初步探索
　　 根據(jù)現(xiàn)有的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族基因aspC和tyrB序列同源性不高的特點(diǎn)，結(jié)合限制性內(nèi)切酶的酶切片段間同源重組和非同源隨機(jī)重組過(guò)程，構(gòu)建了突變文庫(kù)。通過(guò)選擇不同酶切片段的組合，使酶切的位點(diǎn)處于基因aspC和tyrB同源性高的14個(gè)區(qū)域內(nèi)，且不同酶切位點(diǎn)間距離大于20bp，使最終突變文庫(kù)中的基因重組幾率高達(dá)66％。通過(guò)控制酶切片段在PCR重組時(shí)的

7、退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)，適當(dāng)?shù)卦黾踊蚱伍g的非同源隨機(jī)重組，提高了突變庫(kù)的突變率。測(cè)序結(jié)果表明，突變庫(kù)中的重組基因除含有aspC和tyrB基因間的片段交換。這些天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶突變文庫(kù)的研究工作可為該酶進(jìn)行功能改良或新功能的進(jìn)化提供新的酶源，同時(shí)也為進(jìn)一步完善酶分子改造的技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行了有益的探索。
　　 本文的研究工作首次用酶改造的方法提高了天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性，獲得了5種熱穩(wěn)定性提高的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，并對(duì)建立該酶分子改造的技

8、術(shù)平臺(tái)進(jìn)行了系統(tǒng)的探索。
　　 (1)本文提出并建立了基于亞基間相互作用來(lái)選擇定位隨機(jī)突變位點(diǎn)的半合理設(shè)計(jì)方法。此方法有效實(shí)現(xiàn)了天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶分子的改造工作，所獲得的4種突變酶在55℃下的半衰期比初始酶延長(zhǎng)5.6倍，其中一種熱穩(wěn)定性最高的酶(C5)在60℃下的半衰期比初始酶延長(zhǎng)16倍。4種突變酶和初始酶的結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，突變酶的突變殘基，或者形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(例如在突變酶C5、C12中)，或者通過(guò)色氨酸殘基的疏水環(huán)來(lái)增強(qiáng)了殘基間的

9、疏水作用(例如在突變酶C2、C4、C5中)。這些作用的增強(qiáng)提高了亞基間的結(jié)合力，從而提高酶的熱穩(wěn)定性。另外分析突變酶的結(jié)構(gòu)還發(fā)現(xiàn)，酶表面的殘基發(fā)生突變后，會(huì)引起酶活性中心殘基W140、N297*、R292和R386與底物距離產(chǎn)生變化，造成了酶與底物間結(jié)合作用力發(fā)生改變，從而導(dǎo)致了突變酶對(duì)底物親和能力發(fā)生變化。
　　 (2)本文針對(duì)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶分子表面的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，建立了一種定點(diǎn)突變改造天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶分子的簡(jiǎn)易方法。這個(gè)方法可根據(jù)

10、熱穩(wěn)定性不同酶中氨基酸殘基組成的差異來(lái)設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的路線。分析獲得的突變酶Enz N233的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，酶表面loop上氨基酸殘基N233的親水性增加是酶熱穩(wěn)定性提高的主要原因，突變殘基N233和鄰近α-螺旋上殘基E320間相互作用的增強(qiáng)，也可能是酶耐熱性提高的原因之一；酶定點(diǎn)突變后還獲得了一個(gè)熱穩(wěn)定性降低的反例一突變酶Enz K350，對(duì)其結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，鄰近突變殘基周圍，若有電性相同的氨基酸殘基，將可能突變殘基排斥到酶分子的內(nèi)部，造成了

11、酶熱穩(wěn)定性的下降。
　　 (3)本文還結(jié)合同源重組和非同源隨機(jī)重組，探索了定向進(jìn)化中突變文庫(kù)的構(gòu)建方法。這個(gè)方法在酶切片段的同源重組中，增加了非同源隨機(jī)重組的過(guò)程，即克服了基因間同源區(qū)較少而造成同源重組突變率較低的局限，又保留了酶切片段在同源重組中重組幾率高的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)控制重組PCR的條件(退火溫度和PCR循環(huán)數(shù))，可以優(yōu)化突變庫(kù)中的突變率，增大獲得較優(yōu)突變體的可能性；對(duì)酶切片段的選擇，又提高了突變后基因的重組幾率，有利于減少后