羧肽酶B在畢赤酵母中的表達(dá)、純化與活性鑒定.pdf

1、　　羧肽酶B(CPB)是一類水解蛋白或多肽底物C-端Lys或Arg的金屬蛋白酶。當(dāng)前，羧肽酶B已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽的末端修飾，急性胰腺炎及胰腺植皮排斥的血清標(biāo)記，尤其在胰島素原活化為胰島素的過(guò)程中，羧肽酶B是不可缺少的雙酶(胰蛋白酶及羧肽酶B)之一。到目前為止，商業(yè)途徑獲得的羧肽酶B主要從豬胰臟中提取，使得產(chǎn)品價(jià)格昂貴，同時(shí)也不可避免地混雜有其它蛋白酶，如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶。本研究的目的就是試圖以基因工程的方法生產(chǎn)一種高效價(jià)廉的

2、重組CPB產(chǎn)品?！　”緦?shí)驗(yàn)通過(guò)分析鼠proCPB的基因序列，比較其密碼子的組成與酵母偏愛密碼子的差異，在引物設(shè)計(jì)時(shí)采用基因改構(gòu)及密碼子優(yōu)化的策略，對(duì)鼠proCPB基因的5'序列進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)時(shí)以RT-PCR法從SD鼠胰腺細(xì)胞中克隆了proCPB基因，將其插入pPIC9載體后，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115細(xì)胞，在醇氧化酶1(AOX1)強(qiáng)啟動(dòng)子的作用下，首次實(shí)現(xiàn)了鼠羧肽酶原B蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)，并在α-因子信號(hào)肽的引導(dǎo)下成功地分泌到胞外。

3、通過(guò)表達(dá)條件的優(yōu)化，使用BMGY(pH6.0)培養(yǎng)基，添加0.5﹪(m/v)的酪蛋白水解物和3mmol/L的PMSF，于28℃培養(yǎng)，每隔12h補(bǔ)加0.5﹪(v/v)的甲醇，重組酵母GS115-proCPB表達(dá)的重組蛋白可達(dá)500mg/L以上，表達(dá)的目的蛋白占總蛋白的94﹪以上。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)二步疏水、二步離子交換層析及活化后，每升培養(yǎng)基可獲得50mg以上重組CPB產(chǎn)品，得到的CPB純度達(dá)95﹪以上?；钚詼y(cè)定表明，重組proCPB活化后的C