微囊藻毒素LR對小鼠的肝毒性及其分子機理研究.pdf

1、水體中富營養(yǎng)化程度的增加導致了藍藻水華頻繁發(fā)生，而有毒藍藻水華的爆發(fā)引起了人們越來越多的關注。目前發(fā)現，有毒藍藻水華出現在世界各地的富營養(yǎng)化湖泊、池塘和河流中，引起野生動物和家畜疾病及死亡的發(fā)生。在全球范圍內，微囊藻毒素(MCs)是淡水水華中最常見、分布最廣的毒素。現已發(fā)現90余種微囊藻毒素的異構體，其中分布最普遍、含量最多的是MC-LR、MC-RR和MC-YR。本文研究了MC-LR對小鼠肝臟組織病理學、基因、蛋白表達和生化酶活性影響，

2、其中利用HE染色觀察了MC-LR暴露后小鼠肝臟組織結構的變化;利用實時熒光定量PCR(Q-PCR)、蛋白質印跡法(western blot)和分光光度計分析了肝臟功能相關基因、蛋白和酶的活性變化;利用RNA測序技術(RNA-seq)分析了MC-LR暴露后小鼠肝臟組織的轉錄組;利用酶聯免疫法(ELISA)分析了MC-LR暴露后小鼠肝臟炎癥反應相關的蛋白變化。獲得了如下幾個方面的實驗結果:
　　1.MC-LR亞慢性暴露致小鼠肝細胞凋亡

3、
　　急性毒性實驗發(fā)現，MC-LR對小鼠腹腔注射的LD50為70μg/kg(56.74-75.6μg/kg)。實驗采用亞致死劑量的MC-LR(3.75、7.5和15μg/kg)連續(xù)腹腔注射暴露小鼠28 d，染毒7、14、21和28 d分別取材檢測。結果發(fā)現，7.5和15μg/kg MC-LR暴露21和28d明顯增加了小鼠血清丙氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉移酶(AST)活性，而血清堿性磷酸酶(AKP)活性在所有MC-LR處理組暴

4、露28 d時也顯著升高，說明小鼠肝功能受到損傷。同時，MC-LR暴露28 d還引起了小鼠肝臟組織病理學的改變，如7.5和15μg/kg MC-LR處理組引起肝臟炎細胞浸潤，而15μg/kg MC-LR處理組還誘導了肝細胞凋亡。為了進一步探討MC-LR誘導肝細胞凋亡發(fā)生機理，本實驗又檢測了Bcl-2、Bax、cytc、caspase3和caspase9蛋白。結果發(fā)現，MC-LR暴露28d后，Bcl-2蛋白含量比對照組明顯下降，而Bax、c

5、ytc、caspase3和caspase9蛋白含量升高，表明MC-LR導致的肝細胞凋亡可能通過Bax-cyt c-caspase9-caspase3的線粒體通路介導。
　　2.亞慢性MC-LR暴露對小鼠肝臟的氧化損傷及其對Nrf2通路的影響
　　實驗還檢測了MC-LR（3.75、7.5和15μg/kg）暴露28 d對小鼠肝臟的氧化損傷及其對核因子E2相關因子2(Nrf2)調控蛋白和酶活性的影響。結果發(fā)現，處理組Nrf2蛋白含

6、量從MC-LR暴露14d開始處于持續(xù)升高狀態(tài)，表明MC-LR誘導了Nrf2的表達。MC-LR暴露7d后顯著增加了超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)酶活性，醌氧化還原酶1(NQO1)、半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)和血紅素加氧酶1(HO-1)蛋白含量也較對照組增加，這些抗氧化酶和解毒酶活性的增加提高了肝臟清除ROS的能力。隨著暴露時間的延長，盡管谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性、GCLC和HO

7、-1蛋白含量依舊高于對照組，但SOD、CAT、GPx活性和NQO1蛋白含量下降，同時T-AOC也顯著下降，表明肝臟抗氧化能力下降。與對照組相比，高劑量組(7.5和15μg/kg)在MC-LR暴露21 d活性氧(ROS)顯著升高，28 d所有處理組均明顯升高。同時，7.5和15μg/kg MC-LR暴露28 d也導致了丙二醛(MDA)含量的升高。結果表明，Nrf2調控的抗氧化酶和解毒酶在保護機體免受MC-LR毒性中可能起重要作用。

8、　　3.MC-LR暴露對小鼠肝臟細胞色素P450代謝酶的影響
　　細胞色素P450(CYP)是Ⅰ相代謝酶的主要成員，其中參與外源性化學物質代謝和生物轉化的主要是CYP1、CYP2和CYP33個家族。本實驗用低劑量的MC-LR(2、4、和8μg/kg)連續(xù)7d腹腔注射小鼠染毒，在1、3和7d取材檢測肝臟CYP1A1、CYP2E1和CYP3A11 mRNA、蛋白和酶活水平變化。結果表明，MC-LR顯著抑制了小鼠肝臟7-乙氧基異吩惡唑酮

9、脫乙基酶(EROD)活性，但僅2μg/kg MC-LR處理組抑制了小鼠CYP1A1 mRNA表達（1和3d）。同時，CYP1A1蛋白水平變化和EROD酶活性變化也不一致，表明MC-LR抑制EROD酶活性的機制可能涉及到轉錄后和翻譯后水平的調控。MC-LR暴露上調小鼠肝臟CYP3A11 mRNA水平，但降低其蛋白含量。同時，MC-LR在整個暴露時間點和暴露劑量組都明顯抑制小鼠紅霉素N-脫甲基酶(ERND)酶活性。MC-LR能顯著增加小鼠肝

10、臟CYP2E1 mRNA、蛋白水平和苯胺羥化酶(ANH)酶活性，表明CYP2E1可能參與了MC-LR在小鼠肝臟中的代謝。而且，MC-LR暴露丙酮誘導CYP2E1高表達小鼠時發(fā)現，血清酶ALT、AST活性和肝臟ROS含量和MC-LR處理組相比顯著升高，表明CYP2E1可能在代謝MC-LR時誘導產生ROS并與MC-LR的肝毒性及其代謝相關。
　　4.MC-LR暴露后小鼠肝臟轉錄組學分析
　　為深入探討MC-LR毒性作用的分子機制

11、，我們采用了以RNA-seq技術為基礎的數字基因表達譜分析。實驗用10和40μg/kg MC-LR暴露小鼠24 h后檢測處理組和對照組肝臟組織的基因表達譜變化，從中找出差異表達基因(DEGs)，用基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)對這些DEGs進行深入分析。結果發(fā)現，10μg/kg處理組有402個基因顯著上調、38個基因顯著下調;40μg/kg處理組有72個基因顯著上調、76個基因顯著下調。GO生物學過程富集分析發(fā)現

12、，10μg/kg MC-LR處理組DEGs顯著富集了10個GO terms，其中和免疫相關的有innate immune response(GO:0045087)，defense response(GO:0006952)和response to bacterium(GO:0009617)。40μg/kg MC-LR處理組DEGs未發(fā)現顯著富集的GO terms。KEGG分析發(fā)現，10μg/kg MC-LR暴露后小鼠肝臟DEGs參與的生物

13、學通路顯著富集了47條，其中和肝臟免疫相關通路有17條;而40μg/kg MC-LR處理組小鼠肝臟DEGs參與的生物學通路顯著富集了5條。數字基因表達譜分析表明，肝臟炎癥反應可能在MC-LR毒性中起重要作用。
　　5.MC-LR暴露致小鼠肝臟炎癥反應及其機理
　　實驗用5、10、20和40μg/kg MC-LR連續(xù)腹腔注射小鼠染毒7d，在1、3和7d時取材檢測。實驗檢測發(fā)現，MC-LR暴露小鼠主要誘導了促炎因子IL-6、IL

14、-18和MIF的表達。同時，MC-LR暴露抑制了抑炎因子IL-2表達，促進了IL-4和IL-10的表達。該實驗結果表明，MC-LR暴露干擾了小鼠肝臟促炎/抑炎平衡，導致肝臟的炎癥反應及肝功能損傷。實驗還發(fā)現，所有MC-LR處理組均促進Toll樣受體6(TLR6)和TLR9的表達，說明TLR6和TLR9在MC-LR所致小鼠肝臟炎癥反應中可能起重要作用。同時，較高劑量MC-LR(40μg/kg)暴露還顯著增加TLR1、TLR2、TLR11和

15、TLR13的表達，說明高劑量的MC-LR急性暴露可能通過誘導/激活大部分TLRs而介導其炎癥反應。
　　主要研究結論
　　1.亞慢性MC-LR暴露引起小鼠肝臟損傷，可能通過線粒體途徑介導細胞凋亡。
　　2.Nrf2通路在保護機體免受MC-LR毒性中起重要作用。
　　3.CYP2E1可能參與肝臟代謝MC-LR，同時代謝過程中會產生過量ROS，對機體造成氧化損傷。
　　4.MC-LR影響小鼠肝臟促炎/抑炎平衡并