順鉑治療膀胱癌耐藥性研究.pdf

1、前言：
　　膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位，男性發(fā)病率是女性的3～4倍。其中約90％為尿路上皮癌（移行細胞癌），其次為鱗癌和腺癌，分別占3％～7％和2％;約70％～85％的移行細胞癌為表淺性膀胱癌，又稱為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscleinvasive bladder cancer，NMIBC)，術(shù)后約10～15％進展為肌層浸潤性膀胱癌。肌層浸潤性膀胱癌患者預

2、后極差，幾乎50％的患者5年內(nèi)死于膀胱癌。臨床實踐中非肌層浸潤性膀胱癌的一線治療方法為經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(transurethralresection of bladder tumor，TURBT)。然而，TURBT術(shù)后50％～80％的患者會有腫瘤復發(fā)，10％～25％的患者復發(fā)后發(fā)展為肌層浸潤性膀胱癌。術(shù)后易復發(fā)及復發(fā)后惡性程度增高是膀胱癌死亡的主要原因。為了減少腫瘤的復發(fā)及進一步惡化，膀胱內(nèi)化療及免疫治療被廣泛用于淺表性膀胱癌患者術(shù)

3、后的治療中。常用的化療方案有M-VAP（甲氨蝶呤+長春花堿+阿霉素+順鉑）和GC（吉西他濱+順鉑）及MVP（甲氨蝶呤+長春花堿+順鉑）方案，化療的有效率為40％～65％。
　　順鉑(DDP)作為化療一線用藥被廣泛應用于包括膀胱癌在內(nèi)的多種癌癥治療中。其類似于雙功能烷化劑，目前認為，DDP主要作用部位在DNA的嘌呤和嘧啶堿基，與細胞的DNA形成順鉑加合物，影響細胞DNA的復制與轉(zhuǎn)錄，從而導致DNA損傷。順鉑形成的加合物主要是1，2鏈

4、間交聯(lián)，少數(shù)為1，3鏈間交聯(lián)、長鏈交聯(lián)以及DN-蛋白交聯(lián)。但是最年來，腫瘤對順鉑耐藥性的產(chǎn)生嚴重影響了其療效，因此探討腫瘤對順鉑耐藥的機制是克服耐藥、提高療效的關(guān)鍵。
　　有關(guān)順鉑耐藥機制主要有以下幾種觀點:
　　1)耐藥相關(guān)基因的改變、細胞解毒2）染色體改變、凋亡相關(guān)基因的改變、細胞骨架、血管形成及細胞外基質(zhì)密度異常有關(guān)3）DNA修復途徑中順鉑加合物的過度清除也能導致對順鉑的耐藥性
　　磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B

5、[phosphatidylinosito-13-kinase(PI3K)/proteinkinaseB(Akt)，PI3K/Akt]信號傳導通路作為細胞生存過程中重要通路之一，在促進細胞生長、增殖，促進細胞運動、侵襲，抑制細胞凋亡，促進血管生成，抵抗化療和放療等方面起重要作用。近年來，關(guān)于PI3K/Akt信號通路與藥物耐藥性關(guān)系的研究越來越多，并被認為是化療耐藥治療的新靶點。Akt是PI3K/Akt通路中的關(guān)鍵性效應分子，多種腫瘤組織中

6、都有Akt的過度表達和活化。多項實驗表明，化療藥物可增加Akt磷酸化水平，使腫瘤細胞產(chǎn)生化療耐受，深入研究其作用機制，可能為腫瘤的基因治療、抗腫瘤藥物開發(fā)提供新靶點。
　　O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6 methyl-guanine DNA methyltransferase，MGMT)是從細菌到哺乳類動物機體中存在的一種獨特DNA修復酶。順鉑等藥物的細胞毒作用主要是由于DNA內(nèi)O6位鳥嘌呤烷基化所引起。MGMT將烷基從O6

7、鳥嘌呤轉(zhuǎn)移到半胱氨酸殘基內(nèi)，修補DNA的完整性，腫瘤細胞對順鉑等抗癌藥物耐藥常與高水平的DNA修復蛋白MGMT有關(guān)，O6烷基鳥嘌呤修復程度依賴于細胞內(nèi)MGMT的原始水平和新MGMT蛋白合成的程度。未能修復的O6甲基（或氯乙基）鳥嘌呤損害導致致命的DNA鏈內(nèi)交聯(lián)致細胞死亡。要提高順鉑等抗癌藥臨床療效的一個途徑是降低腫瘤細胞內(nèi)MGMT的活性，MGMT滅活劑可以成為化療佐劑。所以，如何通過檢測MGMT活性高低對腫瘤細胞進行預見性化療及通過調(diào)控

8、MGMT的表達以達到最佳化療效果，是目前腫瘤化療中感興趣的問題。
　　本研究旨在檢測PI3K/Ak通路以及MGMT基因在膀胱癌組織及其細胞系中的表達，應用其抑制劑以及滅活劑，探討順鉑治療膀胱癌耐藥性的作用機制，為進一步研究奠定基礎，進而為膀胱腫瘤的治療提供新的方法。
　　第一部分 PI3K/Akt信號途徑與順鉑治療膀胱癌耐藥性研究
　　目的:探討抑制劑LY294002以及Wortmannin能否增強順鉑治療膀胱癌敏感性

9、。
　　方法:選擇人尿路上皮癌T24細胞、5637細胞進行體外實驗，單獨或者聯(lián)合使用LY294002、Wortmannin、順鉑處理細胞系(0，6，12，24，36，48h)，MTT法和克隆形成實驗檢測處理后T24細胞、5637細胞的增殖能力和克隆形成能力，應用Westem Blot方法檢測Akt、p-Akt的表達，使用Hoechst33342熒光染色分析處理后T24細胞、5637細胞的凋亡情況。
　　結(jié)果:順鉑能夠部分活化

10、PI3 K/Akt信號傳導通路，聯(lián)合使用PI3K/Akt抑制劑（LY294002，Wortmannin）和順鉑能夠顯著抑制膀胱癌細胞T24，5637的增殖能力以及克隆形成能力;聯(lián)合用藥組能夠顯著降低膀胱癌細胞T24，5637 p-Akt(308)活化水平，聯(lián)合用藥組能夠顯著增強膀胱癌細胞系T24，5637凋亡情況。
　　結(jié)論:
　　PI3K/Akt抑制劑能夠增強順鉑對膀胱癌細胞系的敏感性，可能為膀胱癌治療提供新方法。

11、　　第二部分 MGMT基因及蛋白表達與順鉑治療膀胱癌耐藥性
　　研究目的:探討MGMT基因在膀胱癌發(fā)生發(fā)展的作用以及滅活劑O6BG能否增強順鉑治療膀胱癌敏感性
　　方法:使用qRT-PCR和Western Blot方法檢測MGMT在100例膀胱癌組織以及配對的27例正常膀胱組織中的表達情況。應用甲基化特異性聚合酶鏈式反應檢測100例膀胱癌組織和27例正常膀胱組織中MGMT基因的甲基化狀態(tài)。使用RT-PCR和Western B

12、lot方法檢測人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1以及膀胱癌細胞系BIU87，T24，5637，J82共5種細胞中MGMT蛋白和mRNA的表達水平。單獨或者聯(lián)合使用O6BG、順鉑處理5637細胞，MTT法和克隆形成實驗檢測其增殖能力和克隆形成能力;應用Western Blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白(Bad，Bax，Bcl2)，Caspase 3、8、9，PARP的表達，使用Hoechst 33342熒光染色檢測分析處理后5637細胞的凋亡

13、情況。
　　結(jié)果:MGMT基因在膀胱癌組織中表達明顯增高;MGMT甲基化水平在膀胱癌組織中低表達，與轉(zhuǎn)錄水平呈負相關(guān)。順鉑能夠降低膀胱癌細胞系中MGMT的表達。聯(lián)合使用O6BG和順鉑能夠顯著抑制膀胱癌細胞5637的增殖能力以及克隆形成能力;聯(lián)合用藥組能夠顯著降低膀胱癌細胞5637抗凋亡蛋白Bad，Bcl2的表達，顯著增強促凋亡蛋白Bax，Caspase3，8，9，PARP的表達;聯(lián)合用藥組能夠顯著增強膀胱癌細胞637凋亡情況。