不同早期液體復蘇方案及氫氣吸收對脂多糖誘導膿毒性休克大鼠肺臟及小腸的作用.pdf

1、目的：
　　 膿毒性休克(septic shock)，因可造成多器官功能障礙或衰竭而具有極高的病死率，一直備受醫(yī)學界關注。早期液體復蘇是逆轉膿毒性休克有效循環(huán)血量不足、防治多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndyome，MODS)的重要和必要手段。急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是膿毒性休克最常見的并發(fā)癥，雖然有臨床試驗報道早期液體復蘇能改善膿毒性休克合并A

2、LI患者的預后，但也有研究稱大量補液可使液體在組織間隙儲留而加重休克患者的肺損傷，那么對膿毒性休克合并ALI的患者，如何進行液體管理成為許多臨床醫(yī)生的困擾。治療膿毒性休克傳統(tǒng)的補液方法為在擴充血容量基礎上，若不能維持有效灌注壓再應用血管活性藥物，而最近有研究報道在補液同時應用升壓藥-去甲腎上腺素，能明顯降低達到目標血壓的補液量，在保證中心灌注壓的同時對末梢循環(huán)也有改善作用。但其對肺功能的影響未見報道。
　　 氧化應激損傷是膿毒性

3、休克重要發(fā)病機制之一，目前臨床上尚無特效的抗氧化治療藥物。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)在LPS誘導膿毒性休克致ALI發(fā)生的過程中，存在嚴重的氧自由基損傷，而且早期液體復蘇對肺臟的氧化應激損傷無明顯改善作用。最近研究證實低濃度氫可以選擇性中和羥自由基，改善氧化應激損傷，而且在缺血-再灌注損傷、炎性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)性疾病等動物模型中，氫分子都顯示了較好的治療效果。目前，氫氣作為抗氧化劑在膿毒性休克領域研究甚少。
　　 膿毒性休克時為了

4、保證心、腦等重要器官的供血，血流出現(xiàn)重新分配，胃腸道的血流量較體循環(huán)減少更為明顯，可出現(xiàn)嚴重的缺血、缺氧及再灌注損傷。胃腸道粘膜的損傷可激活大量炎性介質的釋放，形成炎癥介質的“瀑布效應”，最終導致MODS的發(fā)生。因此保護膿毒性休克過程中腸道功能，對改善膿毒性休克患者的預后具有重要意義。在前期實驗中我們發(fā)現(xiàn)早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入對膿毒性休克中肺損傷具有明顯的改善作用，但這種干預手段對腸道功能的作用尚未見報道。
　　 因此本實

5、驗將利用脂多糖(LPS)誘導膿毒性休克致ALI大鼠模型，研究兩種不同的早期液體復蘇方案對肺功能的影響，從肺損傷角度評價早期與延遲應用去甲腎上腺素的液體復蘇方案對膿毒性休克大鼠肺臟的作用;將早期液體復蘇與2％氫氣吸入作為聯(lián)合干預手段，系統(tǒng)研究其在LPS誘導膿毒性休克過程中，在炎性介質、細胞凋亡、氧化應激等方面對肺臟和小腸功能的影響。
　　 材料與方法
　　 1、膿毒癥休克模型建立
　　 健康雄性Wistar大鼠(1

6、80～200g)，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。75只Wistar大鼠隨機分成5組，正常對照組（A組，n=15），膿毒性休克對照組(B組，n=15)，傳統(tǒng)液體復蘇方案組（C組，n=15），早期應用去甲腎上腺素組(D組，n=15)，早期液體復蘇+2％氫氣吸入組（E組，n=15）。10％水合氯醛(300mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉，氣管切開接呼吸機輔助通氣，呼吸頻率100次/分，潮氣量10 ml/kg，A，B，C，D組吸入氣體為空氣，E組吸入氣體

7、為2％氫空混合氣。左頸動脈穿刺，經(jīng)壓力傳感器連接監(jiān)護儀監(jiān)測心率及平均動脈壓(MAP);股靜脈穿刺留置導管，以備給藥及補液，電熱器維持體溫。除A組外，其余4組LPS15mg/kg緩慢靜脈注射，建立膿毒性休克大鼠模型。
　　 2、方法
　　 (1)實驗一:正常對照組（A組，n=15），膿毒性休克對照組（B組，n=15），傳統(tǒng)液體復蘇方案組（C組，n=15），早期應用去甲腎上腺素組（D組，n=15）。C組液體復蘇方案:生理鹽水

8、10ml/kg/15min，30min后根據(jù)MAP水平，應用去甲腎上腺素(0.5-6μg/kg/min)，D組液體復蘇方案:生理鹽水10ml/kg/15min，同時應用去甲腎上腺素(0.5-6μg/kg/min)，維持MAP于正常水平。記錄各組的生命體征、補液量及去甲腎上腺素的用量。模型建立2h后經(jīng)頸動脈放血處死。留取動脈血行血氣分析，肺組織HE染色，光鏡下觀察病理改變，透射電鏡觀察肺組織超微結構變化，檢測肺組織中氧化還原指標(MDA、

9、MPO、SOD)，ELISA檢測血清和肺泡灌洗液中促炎介質:IL-6、IL-8、TNF-α表達水平。
　　 (2)實驗二:正常對照組（A組，n=15），膿毒性休克對照組（B組，n=15），早期液復蘇組（C組，n=15），早期液體復蘇+2％氫氣吸入組（E組，n=15）。10％水合氯醛(300mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉，氣管切開接呼吸機輔助通氣，呼吸頻率100次/分，潮氣量10 ml/kg， E組吸入氣體為2％氫空混合氣，其余3組吸入氣

10、體為空氣。左頸動脈穿刺，連接監(jiān)護儀監(jiān)測心率及平均動脈壓(MAP);股靜脈穿刺留置導管，以備給藥及補液，電熱器維持體溫。除A組外，其余3組LPS15mg/kg緩慢靜脈注射，建立膿毒性休克大鼠模型。液體復蘇方案:生理鹽水10ml/kg/15min，30min后根據(jù)MAP水平，應用去甲腎上腺素（0.5-6μg/kg/min），維持MAP于正常水平。記錄各組的生命體征、補液量及去甲腎上腺素的用量。
　　 模型建立成功后2h經(jīng)頸靜脈放血處

11、死，留取動脈血行血氣分析，HE染色觀察肺組織病理改變，免疫組化觀察Fas及Bcl-2在肺組織中的表達，Western-blot對肺組織中的Fas及Bcl-2進行半定量檢測，檢測肺組織中氧化還原指標(MDA、MPO、SOD)的表達，ELISA檢測肺泡灌洗液中促炎介質:IL-6、IL-8、TNF-α表達水平。
　　 (3)實驗三:正常對照組(A組，n=15)，膿毒性休克對照組（B組，n=15），早期液復蘇組（C組，n=15），早期液

12、體復蘇+2％氫氣吸入組（E組，n=15）。E組吸入氣體為2％氫空混合氣，其余3組吸入氣體為空氣。液體復蘇方案:生理鹽水10ml/kg/15min，30min后根據(jù)MAP水平，應用去甲腎上腺素(0.5-6μg/kg/min)，維持MAP于正常水平。記錄各組的生命體征、補液量及去甲腎上腺素的用量。大鼠于模型建立成功后2h，經(jīng)頸動脈放血處死，留取動脈血行血氣分析。留取小腸標本，HE染色觀察小腸病理改變，并應用Chiu評分對小腸進行病理損傷半定

13、量評分，透射電鏡觀察小腸細胞器改變情況，TBA法檢測小腸組織中MDA、MPO表達，鄰聯(lián)二回香胺顯色劑法檢測血清DAO表達，ELISA檢測血清中IL-6、IL-8、TNF-α表達水平。
　　 3、統(tǒng)計學分析
　　 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準（(x)±s）差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用t檢驗，相關性分析采用pearson檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、實驗一

14、>　　 (1)補液量及血氣結果:早期應用去甲腎上腺素（D組）與傳統(tǒng)補液方案(C組)比較明顯減少了達到目標血壓所需的補液量，使氧合指數(shù)進一步改善，同時降低了血乳酸水平，組間二氧化碳分壓值比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　 (2) HE染色和電鏡結果顯示早期應用去甲腎上腺素（D組）使肺水腫程度明顯減輕，肺組織中炎性細胞侵潤程度、肺泡充血情況及Ⅱ型肺泡上皮細胞的損傷程度均得到明顯改善。
　　 (3)早期應用去甲腎上腺素（D組）和傳

15、統(tǒng)補液方案（C組）均使血清和BALF中的促炎介質:IL-6、IL-8、TNF-α表達水平下調(diào)，但早期應用去甲腎上腺素使促炎介質表達下降更為明顯，與傳統(tǒng)補液比較差異具有統(tǒng)計學意義;兩種補液方案對IL-6、IL-8、TNF-α在BALF和血清中的比值無影響。
　　 (4)早期應用去甲腎上腺素（D組）僅使MPO表達較傳統(tǒng)補液組及休克對照組明顯下降，早期應用去甲腎上腺素（D組）和傳統(tǒng)補液方案（C組）對SOD和MDA表達均無明顯改善。

16、r>　　 2、實驗二
　　 (1)早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入與單純液體復蘇比較降低了達到目標血壓所需的液體量和去甲腎上腺素的用量;兩種復蘇方案均使血氧分壓得到明顯提高，降低了血乳酸水平，提高血PH值，氫氣吸入聯(lián)合液體復蘇較單純液體復蘇對上述指標改善更為明顯，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義;各組間二氧化碳分壓值比較無顯著差異。
　　 (2)膿毒性休克致ALI過程中氧化應激損傷嚴重，單純液體復蘇對氧化應激損傷改善不明顯（MD

17、A、MPO、SOD無明顯變化）;早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣干預明顯降低了MDA、MPO表達水平，使SOD表達增加，減輕了氧化應激損傷。
　　 (3)早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入與單純液體復蘇比較使肺W/D值明顯下降，HE染色結果提示前者明顯減輕了肺泡壁水腫情況，使肺組織病理損傷得到改善。
　　 (4)免疫組化和Western-blot檢測結果提示，LPS致膿毒性休克過程中肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞凋亡明顯增加，表現(xiàn)在F

18、as表達增加而Bcl-2表達減少，兩種復蘇方案均使肺組織凋亡情況有所改善，但早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入比單純液體復蘇對肺組織細胞凋亡的改善情況更明顯，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 (5)早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入與單純液體復蘇比較進一步降低了BALF中促炎介質:IL-6、IL-8、TNF-α的表達，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 3、實驗三
　　 (1)小腸HE染色結果提示休克對照組小腸絨毛水腫明顯

19、，大量粘膜上皮細胞脫落，絨毛和腺體明顯受損，伴有中性粒細胞侵潤，有的出現(xiàn)潰瘍，小腸上皮細胞結構改變，腸壁水腫，Chiu評分明顯高于正常對照組;早期液體復蘇組與休克對照組比較，上述損傷進一步加重，Chiu評分進一步升高;早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入組上述小腸損傷情況明顯減輕，Chiu評分明顯降低，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 (2)電鏡結果提示早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入與單純液體復蘇比較細胞器損傷情況明顯減輕。
　　

20、 (3)膿毒性休克組腸組織中MDA、MPO活力明顯高于正常對照組(P＜0.05);早期液體復蘇組使MDA、MPO活力進一步升高(P＜0.05);早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入組腸組織中MDA、MPO活力較膿毒性休克組和早期液體復蘇組均明顯下降(P＜0.05)。
　　 (4)休克對照組中血清IL-6、IL-8、TNF-α表達水平較正常對照組明顯升高(P＜0.05);早期液體復蘇使促炎介質(IL-6、IL-8、TNF-α)水平降低(

21、P＜0.05);早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入組與單純液體復蘇比較進一步降低了血清中促炎介質表達水平(P＜0.05)。
　　 (5)休克對照組中血清DAO表達水平較正常對照組明顯升高（6.54±0.68 vs4.32±0.33，P＜0.05）;早期液體復蘇組使DAO水平進一步升高（6.89±0.77 vs6.54±0.68，P＜0.05）;早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入組腸組織中血清DAO水平較膿毒性休克組和早期液體復蘇組均明顯下降

22、（5.14±0.44 vs6.54±0.68;5.14±0.44 vs6.89±0.77,P＜0.05）。
　　 (6)休克對照組中小腸Chiu評分與血清IL-6、IL-8、TNF-α表達，小腸氧化損傷指標(MDA、MPO)、血清DAO及血乳酸值線性相關分析結果提示Chiu評分與各檢測指標有正相關趨勢，但與MDA和血乳酸水平的相關性具有統(tǒng)計學差異（P=0.001和P＜0.001），且與血乳酸值的相關系數(shù)最大(r=0.973)。<

23、br>　　 結論：
　　 1、實驗一
　　 (1) LPS誘導膿毒性休克大鼠早期就并發(fā)急性肺損傷;
　　 (2)傳統(tǒng)液體復蘇方案保證了有效的循環(huán)血量及組織灌注壓，改善了微循環(huán)障礙，使氧分壓及氧合指數(shù)升高，但卻有加重肺水腫的趨勢;
　　 (3)早期應用去甲腎上腺素與傳統(tǒng)液體復蘇方案比較，在保證了有效的循環(huán)血量及組織灌注壓，改善了微循環(huán)障礙的基礎上，進一步減少了復蘇所需液體量，使肺水腫程度減輕，減少了肺泡灌

24、洗液及血漿中促炎介質表達水平，使氧合指數(shù)進一步升高，對肺損傷具有保護作用;
　　 (4)早期液體復蘇對膿毒性休克致肺損傷過程中氧化應激損傷指標改善不明顯。
　　 2、實驗二
　　 早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入與單純液體復蘇比較:
　　 (1)減少了膿毒性休克復蘇過程中達到目標血壓所需的液體量，減輕了肺水腫，改善了肺氧合指數(shù);
　　 (2)減輕了膿毒性休克致ALI過程中肺組織氧化應激損傷程度;

25、>　　 (3)降低了肺泡灌洗液中促炎介質（IL-6、IL-8、TNF-α）的過度表達，減輕過度炎癥反應導致的肺損傷;
　　 (4)使肺組織中促凋亡蛋白Fas表達減少，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達增加，減輕了肺組織細胞的凋亡，減輕了肺損傷程度，保護了肺功能。
　　 3、實驗三
　　 (1) LPS致膿毒性休克過程中小腸功能受到嚴重損傷，表現(xiàn)為粘膜機械屏障損傷、氧化應激損傷和炎性介質的大量釋放;
　　 (2)

26、早期液體復蘇雖然使血漿中促炎介質:TNF-α、 IL-6和IL-8水平下降，但卻加重了小腸粘膜屏障和氧化應激損傷;
　　 (3)早期液體復蘇聯(lián)合2％氫氣吸入治療既降低了血漿中促炎介質水平，又減輕了膿毒性休克過程中小腸機械粘膜和氧化應激損傷，從不同層面保護了腸道功能;
　　 (4)血清炎性介質水平并不能完全、準確反映休克過程中腸道局部損傷程度，血乳酸值與小腸損傷程度具有明顯相關性，因其操作簡單、快捷及無創(chuàng)傷性更適合用于評估