抗菌肽高效表達策略及活性研究.pdf

1、利用基因工程手段生產(chǎn)抗菌肽的過程中，由于抗菌肽對宿主細胞會產(chǎn)生毒性使得蛋白表達受到影響，而改變融合頭是使抗菌肽高效表達策略之一。本實驗利用實驗室已經(jīng)成功構建并保存的工程菌，分析其誘導后OD600的變化以及不同融合頭對G13毒性的影響。實驗對pET28a-G13進行突變，以改變G13的N端融合頭凈正電荷數(shù)。設計突變引物，以質粒pET28a-G13為模板，PCR擴增序列，構建突變體pET28a′-G13，并進行誘導。對共表達工程菌在不同的抗

2、生素比例下進行誘導，Tricine-SDS-PAGE電泳檢測，比較分析抗生素比例對蛋白表達的影響，同時比較抗生素比例不同質粒的拷貝數(shù)的變化。試驗發(fā)現(xiàn)融合頭對G13毒性抑制效果與其凈負電荷數(shù)及其氨基酸分布有關。
　　 此外，針對本實驗室已經(jīng)摸索出的重組G13結構域的表達的方法進行改良，通過改變溶解蛋白的變性劑，以及改變其濃度等方法，希望能夠減少尿素對重組肽的修飾。而且，在對純化得到的G13進行了初步的檢測之后，對于G13的活性研究

3、進行了擴展，進一步研究G13結構域的溶血活性作用并對結果進行統(tǒng)計分析。
　　 另外本實驗對抗菌肽vgf-1的表達和活性進行了初步研究。通過對NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫的檢索查詢找到了一個從眼鏡蛇蛇毒中提取的具有抗結核桿菌效用的小肽Vgf-1。根據(jù)Vgf-1氨基酸序列和大腸桿菌的密碼子偏好性，得出Vgf-1的基因序列。設計采用重疊PCR的方法得到基因序列。分三步擴增Vgf-1的基因片段(A,B,C)，這三個片段經(jīng)過膠回收后分別均與表達載

4、體pBAD/TOPO連接，轉化感受態(tài)細胞E.coli TOP 10，經(jīng)過測序鑒定，分別命名為 pBAD-Vgf-1-A,B,C。用阿拉伯糖誘導4h，經(jīng)超聲破碎處理后，SDS-PAGE電泳檢測，融合蛋白的位置正確，且可以看出大多數(shù)目的蛋白以包涵體的形式存在。用Bradford方法測菌體總蛋白量，用Bandscan 軟件分析融合蛋白的表達量分別約占總體蛋白量的58.3％、48.7％和45.5％，因此推算出推算每升工程菌發(fā)酵液產(chǎn)生的包涵體約為