端粒與端粒酶在硼替佐米和ARID1A抑制腫瘤進展中的功能學研究.pdf

1、端粒是位于真核染色體末端，由短的DNA重復序列TTAGGG和相關蛋白質組成的復合物。其主要作用是保護染色體，既可防止染色體被核酸酶降解，同時又能阻止相鄰染色體間的融合。另外，端粒的長度反應細胞的可分裂次數，因此，被稱為細胞的“生命鐘”。正常情況下，端粒DNA會隨著細胞的每次分裂而縮短50-200個堿基對，當其縮短到一定長度時，染色體則無法完成正常復制，細胞的有絲分裂也會隨之停滯，轉而進入衰老階段。端粒酶是一種RNA依賴的DNA聚合酶，由

2、催化組分端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、端粒酶模板RNA(hTER)以及端粒酶相關蛋白質組成，其主要作用是延長端粒的長度。在正常的成熟體細胞中，端粒酶幾乎沒有活性，但是，在病理狀態(tài)下，如腫瘤細胞中，其活性異常增高，使端粒長度得以延長，從而保證了腫瘤細胞的無限分裂增殖。由此可見，端粒酶活性的異常升高所導致的端粒長度的維持，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。
　　硼替佐米是已經應用于臨床的用來治療多發(fā)性骨髓瘤的一種藥物，作為26S蛋白酶體的抑制

3、劑，其已知的主要作用機制是通過抑制NF-κB信號途徑，進而激活caspase3,同時抑制抗凋亡基因bcl-2的表達，來誘導腫瘤細胞的凋亡。雖然硼替佐米在多發(fā)性骨髓瘤的治療中已經取得了良好療效，但仍有部分耐藥病例出現，因此，我們亟需尋找硼替佐米新型的作用機制以及靶點分子，以使其獲得更加合理的臨床應用。
　　腫瘤抑制因子arid1a是染色質重構復合體SWI/SNF的重要組成成分，可結合于DNA的特定區(qū)域，此復合體中的另一成員BRG1或

4、BRM可水解ATP產生能量，利用這些能量，SWI/SNF重構復合體可使染色質中核小體的組蛋白核心發(fā)生移位甚至脫落，從而轉移核小體的位置，改變染色質的構象，使下游基因的轉錄起始部位暴露或隱藏，由此來調控下游基因的轉錄。目前，眾多的基因測序結果顯示，在卵巢癌、胃癌、腎癌、胰腺癌等絕大多數腫瘤中都存在ARID1A基因的突變或缺失，這提示arid1a可能作為一種抑癌基因來行使作用。但是，具體的抑癌機制目前研究尚少。
　　研究目的：

5、　　1.探討硼替佐米誘導腫瘤細胞凋亡的過程中，對端粒酶活性和端粒功能的影響，以發(fā)掘其新的作用機制，并對腫瘤細胞產生硼替佐米耐藥過程中hTERT所發(fā)揮作用進行研究。
　　2.探討胃癌細胞中arid1a對hTERT表達的調控及其相關機制，為arid1a的抑癌作用提供證據支持。
　　研究方法和結果:
　　1.硼替佐米降低端粒酶活性和端粒穩(wěn)定性誘導腫瘤細胞凋亡
　　(1)硼替佐米抑制腫瘤細胞端粒酶活性，同時降低其端粒穩(wěn)定

6、性。
　　硼替佐米處理白血病細胞HEL和胃癌細胞BGC-823前后，分別用PCR-ELISA試劑盒檢測端粒酶活性，qRT-PCR檢測hTERT、hTER及端粒結合蛋白TRF1、TRF2、POT1、RAP1、TPP1及TIN2的mRNA表達，Western Blotting檢測 TRF1、TRF2、POT1的蛋白表達，流式-熒光原位雜交(Flow-FISH)和qPCR檢測端粒長度，免疫-熒光原位雜交(Immuno-FISH)檢測端粒

7、DNA的損傷。結果表明，硼替佐米可下調hTERT、hTER的mRNA表達水平，降低端粒酶活性，使端粒結合蛋白的表達廣泛失調，縮短端粒長度并導致端粒功能異常。
　　(2) hTERT高表達可減弱由硼替佐米引起的端粒功能異常。
　　硼替佐米處理穩(wěn)定高表達hTERT基因的細胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT后，Flow-FISH和qPCR檢測細胞端粒長度，Immuno-FISH檢測端粒DNA損傷，qRT-PCR檢測

8、端粒結合蛋白TRF1、TRF2、POT1、RAP1、TPP1及TIN2的mRNA表達，Western Blotting檢測TRF1、TRF2、POT1的蛋白表達。結果表明，硼替佐米處理后HEL-hTERT和BGC-823-hTERT細胞中端粒長度無明顯改變，端粒DNA損傷和端粒結合蛋白的表達失調程度明顯弱于相同濃度硼替佐米處理的HEL-control和BGC-823-control細胞。
　　(3) hTERT高表達可抑制由硼替佐

9、米所誘導的腫瘤細胞凋亡。
　　硼替佐米處理穩(wěn)定高表達hTERT基因的細胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT與對照細胞株HEL-control、BGC-823-control后，臺盼藍染色計數確定細胞的存活率，Annexin-Ⅴ染色后流式細胞術檢測細胞的凋亡率。結果表明，硼替佐米處理后，HEL-hTERT和BGC-823-hTERT細胞的存活率明顯高于HEL-control和BGC-823-control細胞，而HEL

10、-hTERT和BGC-823-hTERT細胞的凋亡比例明顯低于HEL-control和BGC-823-control細胞。
　　(4) hTERT通過減弱DNA損傷和上調bcl-2表達抑制腫瘤細胞凋亡。
　　硼替佐米處理穩(wěn)定高表達hTERT基因的細胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT與對照細胞株HEL-control、BGC-823-control后，免疫熒光檢測DNA損傷，即53BP1的凝集，Western

11、Blotting檢測bcl-2的表達。結果表明，HEL-hTERT與BGC-823-hTERT細胞中的DNA損傷明顯少于HEL-control與BGC-823-control細胞，HEL-hTERT細胞內bcl-2表達明顯高于HEL-control細胞，且在硼替佐米處理后HEL-hTERT細胞內仍存留較多量的bcl-2蛋白。
　　2.染色質重構分子ARID1A負性調控hTERT抑制胃癌進展
　　(1) arid1a負性調控h

12、TERT表達。
　　胃癌細胞系AGS和SGC中轉染arid1a高表達或對照質粒PcDNA6.0后，采用qRT-PCR和western blotting分別檢測hTERT的mRNA及蛋白表達水平。結果表明，arid1a高表達后，hTERT的mRNA及蛋白表達均下降。
　　(2) arid1a抑制hTERT啟動子活性。
　　AGS和SGC細胞中轉染arid1a高表達或對照質粒PcDNA6.0后，再轉染hTERT啟動子報告基

13、因質粒，然后采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測hTERT啟動子活性。結果表明，arid1a高表達后，hTERT啟動子活性明顯降低。
　　(3) arid1a抑制c-myc在hTERT啟動子區(qū)的結合，但不改變c-myc的表達量。
　　AGS和SGC細胞中轉染arid1a高表達或對照質粒PcDNA6.0后，qRT-PCR檢測c-myc的mRNA表達，結果顯示arid1a未影響c-myc的mRNA水平。在轉染了arid1a高表達或對照

14、質粒PcDNA6.0的AGS和SGC細胞中，轉染c-myc結合位點突變的hTERT啟動子質粒，用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測突變的hTERT啟動子活性，結果顯示，其活性未受arid1a高表達的影響。
　　研究結論:
　　1.硼替佐米可以通過降低HEL和BGC-823細胞的端粒酶活性和端粒穩(wěn)定性誘導細胞凋亡，而hTERT可減弱硼替佐米對端粒功能的影響，介導腫瘤細胞對硼替佐米的耐藥。
　　2.Arid1a通過阻礙c-myc在