杜氏鹽藻GFP表達(dá)載體的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)化.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增了RR-gfp和gfp片段，并分別與含有鹽藻強(qiáng)啟動(dòng)子的載體連接，構(gòu)建了2種帶有g(shù)fp報(bào)告基因的新型質(zhì)粒表達(dá)載體p215t和p115t，質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果從分子水平證明載體構(gòu)建成功。質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化EscherichiacoliMC4100A細(xì)胞，探討了外源基因gfb在原核宿主中的表達(dá)。用p215t和p115t分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，gfp基因在原核宿主中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，但熒光蛋白產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的分布有所不同。用p215t轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子

2、熒光在細(xì)胞周?chē)纬梢粋€(gè)光圈或分布在兩極。在p215t中，gfp基因上游存在RR-信號(hào)肽序列，信號(hào)肽介導(dǎo)熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了轉(zhuǎn)運(yùn)。p115t中不存在信號(hào)肽序列，熒光均勻分布于轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 本實(shí)驗(yàn)采用電擊法將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化Dunaliellasalina細(xì)胞，對(duì)藻齡、電擊緩沖液以及電場(chǎng)強(qiáng)度3種電轉(zhuǎn)參數(shù)分別進(jìn)行了探討，確定了本實(shí)驗(yàn)條件下的最佳轉(zhuǎn)化條件。實(shí)驗(yàn)證明，選擇藻齡為7d的細(xì)胞，電擊緩沖液組分為1.0mmol·L-1HEPES+0.

3、5mol·L-1甘油，電場(chǎng)強(qiáng)度為6kV·cm-1進(jìn)行轉(zhuǎn)化可獲得本實(shí)驗(yàn)條件下最佳轉(zhuǎn)化效果，載體p215t和p115t的最高轉(zhuǎn)化率分別為1.00‰和1.02‰。 由于缺乏細(xì)胞壁，鹽藻細(xì)胞對(duì)于滲透壓十分敏感。在電擊轉(zhuǎn)化過(guò)程中，維持細(xì)胞滲透壓是提高轉(zhuǎn)化效率的有效方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加甘油改進(jìn)電擊緩沖液成分，討論了甘油對(duì)于提高轉(zhuǎn)化前細(xì)胞存活率的作用，同時(shí)研究了不同濃度甘油對(duì)于鹽藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)證明，用含有0.5mol·L-1甘油的HE

4、PES緩沖液處理轉(zhuǎn)化前細(xì)胞可獲得最高存活率，約86％。當(dāng)甘油被添加到鹽藻培養(yǎng)基時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度甘油能夠促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)，高濃度甘油對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)具有毒害作用；培養(yǎng)基中含有5mmol·L-1甘油對(duì)于維持細(xì)胞生活力、促進(jìn)總生物量的積累具有最佳效果。電擊轉(zhuǎn)化效果和甘油生理實(shí)驗(yàn)均表明，0.5mol·L-1甘油可作為鹽藻電擊轉(zhuǎn)化過(guò)程中一種良好的穩(wěn)滲劑。 用質(zhì)粒載體p215t和p115t分別轉(zhuǎn)化杜氏鹽藻細(xì)胞，報(bào)告基因gfp均能成功在藻細(xì)胞中