大豆灰斑病抗性鑒定方法及轉(zhuǎn)BnERF104大豆的灰斑病抗性研究.pdf

1、大豆灰斑病世界性分布,是我國大豆主產(chǎn)區(qū)的重要病害,尤以東北三省危害嚴重。目前防治灰斑病主要通過利用抗病品種和化學(xué)農(nóng)藥防治?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用費用和殘留及藥害等問題使得化學(xué)防治只能作為應(yīng)急措施；而種植抗病品種的防治技術(shù)成本低,是基礎(chǔ)的、主要的防治技術(shù)。然而,灰斑病生理小種易發(fā)生變化,導(dǎo)致品種喪失抗性,因此,培育廣譜持久抗病品種是當(dāng)前的迫切需要。其途徑有兩條:一、從已有大豆品種中鑒定發(fā)掘；二、利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入具有廣譜抗性的基因。后者可通過激

2、活植株防衛(wèi)反應(yīng),如超表達某個轉(zhuǎn)錄因子激活防衛(wèi)反應(yīng)下游基因的表達,從而有效提高品種的廣譜持久抗病性。
　　 不管是在現(xiàn)有大豆資源中篩選,還是通過轉(zhuǎn)基因創(chuàng)造培育主效+廣譜的持久抗病品種,都需要一個高效、準確的抗病性鑒定方法。目前大豆灰斑病的鑒定大多采用田間孢子接種法,該方法存在時間長、易受環(huán)境和接種條件等因素的影響、鑒定結(jié)果重復(fù)性差等缺點。因此,迫切需要建立室內(nèi)快速、準確、重復(fù)性好、可區(qū)分對單個小種抗性的大豆灰斑病抗性鑒定方法。本研

3、究首先探討建立能夠滿足上述研究需求的抗病性鑒定方法,在此基礎(chǔ)上,通過轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子BnERF104探討提高大豆灰斑病廣譜抗病性。獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.大豆灰斑病菌絲塊離體葉接種快速鑒定方法建立
　　 利用大豆灰斑病菌1號和7號生理小種,6個抗性不同的大豆材料,研究了大豆灰斑病抗性的菌絲塊離體葉接種快速鑒定方法。結(jié)果表明,在28℃、200μE·m-2·s-1光照強度和12h光照／12h黑暗條件下,將Minimal培

4、養(yǎng)基生長的菌絲塊分別接種抗、感大豆葉片,病斑面積在不同的材料之間差異明顯,其鑒定結(jié)果與已報道的這些品種抗性水平一致。該鑒定方法具有不受生育期和環(huán)境條件限制、重復(fù)性強、可區(qū)分單個生理小種抗性等優(yōu)點,是大豆灰斑病抗性室內(nèi)鑒定的一種有效方法。
　　 2.轉(zhuǎn)BnERF104大豆植株的獲得
　　 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達載體OX-BnERF104轉(zhuǎn)化大豆(東農(nóng)50)子葉節(jié),通過芽的再生、芽的伸長、生根、移栽等階段,獲得轉(zhuǎn)基因再生植株

5、。在芽伸長過程中,通過噴施20mg／L BASTA的方法可以有效地對再生芽進行篩選。大豆再生芽的生根,牢較低,一直是轉(zhuǎn)化植株獲得的瓶頸。在生根培養(yǎng)基中用特美汀代替頭孢,添加0.1％的活性炭和將IBA濃度提高到2mg／L能顯著的提高再生芽不定根的發(fā)生。通過PCR鑒定,共獲得20株T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株。熒光定量PCR結(jié)果顯示,部分轉(zhuǎn)基因大豆中BnERF104的表達量顯著上調(diào)。
　　 3轉(zhuǎn)基因植株對大豆灰斑病抗性鑒定
　　 對