α-1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因新突變位點與功能關(guān)系的研究.pdf

1、H抗原與ABO血型、Lewis血型密切相關(guān),屬于Hh血型系統(tǒng).Hh血型系統(tǒng)存在孟買型和類孟買型兩種罕見表型,表現(xiàn)為紅細胞上完全或部分缺失H抗原.紅細胞上H抗原受控于Q.1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Q 1,2-fucosyltransfcrase gene,FUTl),已證實FUTl突變可導(dǎo)致孟買型和類孟買型.本實驗室在前期研究中通過對FUTl基因編碼序列分析,發(fā)現(xiàn)類孟買型的一個新突變類型(682A>G+35C>T),該復(fù)合突變分別導(dǎo)致A1

2、2V和M228V氨基酸替換.國內(nèi)外有關(guān)學者認為35C>T是引起類孟買型的突變點(命名為h4),但我們通過人群頻率調(diào)查和15種哺乳動物同源的FUTl糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列比對,認為35C>T.是多態(tài)性位點,應(yīng)與FUTl酶活性和類孟買型無關(guān),推測應(yīng)是682A>G突變引起H抗原減弱.本研究目的旨在從體外實驗明確該新突變類型(682A>G+35C>T)的機制,從蛋白質(zhì)和mRNA水平對35C>T,682A>G突變和α-1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶功能的關(guān)系

3、進行研究,以解決35C>T和682A>G在體外實驗中對H抗原表達的影響. 方法： 1.類孟買型先證者采用血清學和分子生物學技術(shù)鑒定,實驗以類孟買型先證者基因組DNA為研究對象,經(jīng)PCR擴增FUTl全長編碼序列后割膠回收純化.通過TOPO TA克隆將目的DNA片段連接至表達載體pcDNA3.1/V5-His,克隆篩選后獲取重組質(zhì)粒DNA進行測序分析,以獲取包含有目的基因片段的重組質(zhì)粒,包括35T、682G+35T和正常對照

4、682A+35C的重組質(zhì)粒. 2. 按照常規(guī)細胞培養(yǎng)方法在培養(yǎng)板上培養(yǎng)貼壁細胞COS-7細胞株,將重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法分別轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期COS-7細胞. 3.轉(zhuǎn)染后COS-7細胞經(jīng)G418篩選,采用直接免疫熒光染色的方法于第2天、第3天、第4天、第7天流式細胞術(shù)分析細胞表面H抗原的表達情況. 4.采用實時熒光定量PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)染第1天,第2天,第3天的細胞檢測mRNA水平FUTl的表達情況,以G6PD

5、為內(nèi)參基因,FUT1為目的基因,分別選用標準PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒純品作為標準品做標準曲線對樣本進行定量比較. 結(jié)果： 1.獲取目的基因重組質(zhì)粒以先證者或正常對照基因組DNA為模板,FIJTlF和FUTlR引物對擴增FUTl基因,2﹪瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示可見分子量為1094bp的特異性條帶,將其割膠回收片段TOPO TA.克隆,提取質(zhì)粒測序分析結(jié)果,分別獲取35T、682G+35T和正常對照682A+35C的重組質(zhì)粒.

6、 2.轉(zhuǎn)染后抗原分析通過FITC標記的抗H抗體對轉(zhuǎn)染后COS-7細胞表面的H抗原進行檢測,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的COS-7細胞不表達H抗原,第2天后H抗原分別在35T、682G+35T和682A+35C三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-7細胞膜上表達,表達量隨著時間呈現(xiàn)先遞增后下降的趨勢,在第4天達最大值.與野生型(682A+35C)重組質(zhì)粒相比,(682G+35T)質(zhì)粒H抗原的表達量僅為野生型的13.3﹪,而35T.為野生型的52.7﹪.

7、 3.轉(zhuǎn)染后mRNA分析我們通過標準品繪制雙標準曲線分別對轉(zhuǎn)染第1天、第2天、第3天的COS-7細胞胞內(nèi)FUTl目的基因與G6PD內(nèi)參基因進行了定量分析和比較.結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后FUTl mRNA水平隨著時間變化呈遞減,在第l天(682G+35T)FUTl mRNA水平僅為(682A+35C)的40﹪. 結(jié)論：1.實驗成功獲得了FUTl重組表達質(zhì)粒,構(gòu)建了FUTl體外瞬時表達體系,體外從蛋白質(zhì)水平證實類孟買型H抗原呈弱表達的特點