脂肪酶產生菌的篩選、酶基因克隆及應用研究.pdf

1、脂肪酶是一種酯鍵水解酶，它們能夠進行非水相催化的特性使其能夠用于生產許多高附加值的、用化學方法難以合成的水不溶性產品，目前在非水介質中的脂肪酶催化反應已經被成功應用在多肽合成、聚合物合成、藥物合成、立體異構體拆分、精細化工、食品和香料生產及油脂改性等，成為當前生物技術領域的一個研究熱點。 本論文主要從脂肪酶產生菌的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化、誘變育種、脂肪酶基因的克隆、脂肪酶在有機相中的催化等幾方面進行了研究。 本論文首先經過富

2、集、平板初篩及搖瓶復篩試驗，篩選到具脂肪酶活的菌株80余株，其中C3酶活較高。C3和G5固定化脂肪酶能夠高效催化轉酯反應生產生物柴油。通過對C3和G5進行18S rDNA分析，結合形態(tài)觀察，初步確定此兩株菌都屬于地霉菌屬(Geotrichum)。對C3胞外粗酶液酶基本性質的研究表明：C3脂肪酶胞外粗酶液作用的最適溫度為40℃，最適作用pH為7.5，在50℃以內和pH6.0～8.0之間有較好的穩(wěn)定性。隨后，對篩選到的C3菌株液體搖瓶產脂肪

3、酶的條件進行了優(yōu)化。確定其最適產酶條件為：黃豆粉1.5g蛋白胨1.0g硫酸銨0.5g蔗糖1.5g KH2PO4 0.1g MgSO4·7H2O 0.05g橄欖油1mL H2O 100mL pH6.5。然后，用紫外線及EMS對G5進行誘變育種。結果證明EMS誘變效果較好。G5經EMS誘變后傳代3次，酶活比出發(fā)菌株提高了168.6％。 我們根據G. geotrichum脂肪酶基因核酸序列的保守區(qū)域，利用熱不對稱交錯PCR(TAIL-

4、PCR)技術擴增得到了G5脂肪酶基因的全序列，此基因沒有內含子，全長1692bp，編碼563個氨基酸，對其進行了生物信息學分析。 最后，對固定化的G5脂肪酶在有機相中催化轉酯化反應進行了嘗試，此酶可以轉化橄欖油、棉籽油、煎炸廢油等多種底物生產生物柴油，對橄欖油的酯化率達到54％。在有機相中還利用此G5脂肪酶對生物表面活性劑槐糖脂進行了結構修飾，對修飾后的槐糖化酶脂的抑菌活性進行了研究，實驗證明，通過修飾提高了其對石膏樣毛癬菌和紅