自噬對HUVECs增殖和血管形成中的影響及其作用機制.pdf

1、目的：本實驗研究擬探討自噬激活或抑制對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和血管形成的影響及其可能的作用機制，為治療深靜脈血栓形成提供理論依據(jù)。
　　 方法：人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)’加入不同濃度雷帕霉素(0.01μ g/L、0.1μ g/L、1μ g/L、10μ g/L)和不同濃度的3-MA(1.25mmol/L、2.5mmol/L、5.0mmol/、10.0m

2、mol/L)，分別培養(yǎng)24小時。1、MTT法觀察其增殖能力的變化，2、FCM檢測細胞凋亡情況，3、Western blot檢測細胞內(nèi)組織蛋白酶、LC3-Ⅱ表達的變化，4、ELISA檢測上清液中VEGF、bFGF表達變化，5、電鏡觀察細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。均數(shù)以(x±s)表示，采用單因素方差分析比較各組均數(shù)，(P<0.05)有統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：1、雷帕霉素濃度在0.01μg/L時，對HUVECs

3、增殖的抑制作用不明顯，濃度在0.1μ g/L及以上抑制作用顯著，(P<0.05)；3-MA濃度在1.25mmol/L時對HUVECs的增殖促進作用不明顯，濃度在2.5mmol/L及以上時促進作用明顯，(P<0.05)。2、FCM檢測結(jié)果表明，2.5mmol/L及以上3-MA組明顯抑制HUVECs凋亡，而1.25mol/L組作用不明顯；0.1μ g/L及以上雷帕霉素組促進HUVECs凋亡作用顯著，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.05)

4、。3、雷帕霉素各濃度組LC3-Ⅱ表達呈明顯升高的趨勢，0.1μ g/L及以上雷帕霉素組組織蛋白酶B的表達呈明顯升高的趨勢；3-MA各濃度組LC3-Ⅱ表達呈明顯降低的趨勢，2.5mmol/L及以上3-MA組組織蛋白酶B表達呈明顯降低的趨勢，(P<0.05)。4、2.5mmol/L及以上3-MA濃度組VEGF表達較對照組明顯升高，(P<0.05)；0.1μ g/L及以上雷帕霉素組VEGF表達明顯低于對照組，與對照組比較(P<0.05)；3-

5、MA各濃度組bFGF的表達較對照組明顯升高；0.01μ g/L雷帕霉素組不影響bFGF的表達，0.1μ g/L及以上雷帕霉素組bFGF表達明顯低于對照組，(P<0.05)。5、透射電子顯微鏡下雷帕霉素組HUVECs可見線粒體腫脹、溶酶體增多、自噬囊泡形成等細胞超微結(jié)構(gòu)變化，3-MA組胞漿中沒有明顯的獨立雙層膜結(jié)構(gòu)自噬囊泡出現(xiàn)，也沒有發(fā)現(xiàn)自噬溶酶體，但可見部分線粒體發(fā)生腫脹，變圓，個別細胞空泡化，基質(zhì)變淺，嵴變少，出現(xiàn)縱向嵴和同心圓嵴。<