紅豆杉細胞培養(yǎng)過程中褐化機理及其控制.pdf

1、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產珍貴次級代謝產物是目前最具應用前景的植物資源替代技術之一，并且該技術仍在不斷擴展其應用領域，例如生產異源動物蛋白等。但是植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的產業(yè)化應用還有很多關鍵問題亟待解決，其中，褐化現(xiàn)象幾乎存在于所有植物細胞培養(yǎng)的應用和研究中，以及植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的放大過程中，是嚴重妨礙植物細胞培養(yǎng)技術應用的關鍵問題之一。然而，由于植物細胞本身的特點及其培養(yǎng)環(huán)境的復雜性，目前，人們對其褐化機理仍然沒有清楚地認識，褐化問題仍無

2、有效的控制方法。因此，本論文以極易發(fā)生褐化、且具有應用前景的紅豆杉細胞為典型實驗材料，通過系統(tǒng)研究揭示植物細胞培養(yǎng)的褐化機理，并在此基礎上建立針對、有效控制方法。
　　本研究主要內容包括：⑴系統(tǒng)研究了紅豆杉細胞培養(yǎng)過程中的褐化特征，并證明紅豆杉細胞培養(yǎng)褐化現(xiàn)象屬于生理的酶促褐化反應。表現(xiàn)在：褐化現(xiàn)象發(fā)生于紅豆杉細胞培養(yǎng)的整個放大過程之中，并且該現(xiàn)象是在沒有加熱處理的常溫培養(yǎng)狀態(tài)下發(fā)生的；當培養(yǎng)基中只含蔗糖成分，并且是通過過濾除菌方

3、式添加時，褐化現(xiàn)象仍然發(fā)生；硫代硫酸鈉可通過抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性來控制褐化現(xiàn)象的發(fā)生；超生聲處理模擬機械損傷可誘導提高紅豆杉細胞培養(yǎng)褐化程度。⑵證明可代謝碳源調控的酚類物質合成是引起紅豆杉細胞培養(yǎng)酶促褐化的決定性因素。系統(tǒng)研究了細胞懸浮培養(yǎng)的環(huán)境因素（培養(yǎng)基成分、滲透壓、流體剪切、溶氧、蔗糖濃度、碳源）和酶促褐化之間的關系。發(fā)現(xiàn)雖然上述因素均在一定程度上影響褐化程度，但是培養(yǎng)液中蔗糖成分影響

4、最大。當培養(yǎng)液中無蔗糖存在時，無褐化現(xiàn)象發(fā)生；當提高培養(yǎng)液中蔗糖濃度時，細胞總酚合成能力增強，導致褐化程度升高；并且在紅豆杉細胞中超表達蔗糖代謝關鍵酶中性/堿性蔗糖轉化酶（Neutral/alkaline invertase，NINV）基因同樣可通過促進酚類物質合成提高褐化程度。此外，葡萄糖和果糖作為碳源同樣可通過促進總酚合成導致褐化現(xiàn)象的發(fā)生，而非代謝糖如甘露醇和山梨醇作為碳源卻不能導致褐化現(xiàn)象的發(fā)生。在培養(yǎng)液中含有可代謝碳源的前提下

5、，滲透壓和流體剪切主要通過對細胞造成損傷，促進細胞內酚類物質和PPO釋放并相互接觸，從而誘發(fā)酶促褐化反應的發(fā)生；提高培養(yǎng)液中溶氧水平，可通過促進總酚合成導致褐化程度升高。⑶發(fā)現(xiàn)黃酮類物質是引起紅豆杉細胞培養(yǎng)酶促褐化的主要酚類物質。主要證據為：通過對兩種細胞系（嚴重褐化細胞系和非褐化細胞系）的比較分析，并且提取培養(yǎng)液中的褐色物質行紫外全波長掃描以及HPLC-MS/MS檢測分析，證實黃酮類物質是引起酶促褐化反應的主要酚類物質，并推測楊梅素和

6、槲皮素是參與該反應的具體黃酮類物質。赤霉素作為抑制劑可通過抑制黃酮物質的合成而阻止紅豆杉細胞培養(yǎng)酶促褐化的發(fā)生，進一步驗證了上述結論。通過研究赤霉素對紅豆杉細胞轉錄組和黃酮代謝產物的影響，揭示了赤霉素阻止紅豆杉細胞培養(yǎng)酶促褐化的機理。赤霉素處理雖然整體上提高了苯丙烷途徑和黃酮合成途徑的大部分基因的表達量，但是對苯丙烷途徑的關鍵酶肉桂酸-4-CoA連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）基因以及黃酮醇合成關鍵酶黃酮醇

7、合成酶（Flavonol synthase，F(xiàn)LS）基因表達起到明顯的抑制作用，最終抑制了總黃酮和黃酮醇物質（楊梅素和槲皮素）的合成，從而阻止了酶促褐化的發(fā)生。⑷根據上述研究結果，概括、總結了紅豆杉細胞培養(yǎng)酶促褐化機理，并在此基礎上建立了3種可行有效的控制方法。蔗糖流加培養(yǎng)：通過降低細胞培養(yǎng)初期蔗糖濃度降低酚類物質的合成，從而降低的褐化程度。小細胞聚集體培養(yǎng)：小細胞聚集體可降低流體剪切對細胞的損傷而避免酶促褐化的發(fā)生，顯著促進生物量的積