基于DNA探針的電化學(xué)檢測技術(shù)研究.pdf

1、隨著基因工程的迅猛發(fā)展，傳統(tǒng)的分析和檢測方法已不能滿足當前需要，很多新的檢測器件和分析方法應(yīng)時而生，電化學(xué)DNA生物傳感器便是其中的一個。電化學(xué)DNA生物傳感器的原理是檢測由 DNA探針所提供的分子識別過程，然后通過一個換能器將測量結(jié)果轉(zhuǎn)換為可識別的電化學(xué)信號[1]。
　　對特定DNA片段或者小分子蛋白的檢測在診斷基因相關(guān)疾病、監(jiān)測環(huán)境和軍事反恐等方面都有十分重要的意義。研究電化學(xué)DNA生物傳感器就是為了滿足對特定DNA片段或者小

2、分子蛋白的高靈敏度檢測、高選擇性檢測和方便快捷檢測的需要。一般來說，DNA傳感器依據(jù)檢測手段的不同大致可以分為三類：聲學(xué)傳感器、光學(xué)傳感器和電化學(xué)傳感器等。由于電化學(xué)檢測手段具有高靈敏、低能耗、方便快捷和低成本等特點，使其成為一個十分活躍的研究領(lǐng)域并得到了迅猛發(fā)展。
　　本文對DNA生物傳感器進行了系統(tǒng)的研究，以適配體和DNA樹枝狀聚合物修飾電極并應(yīng)用于8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷和特定序列 DNA的檢測。主要內(nèi)容包括以下四個方

3、面：
　　1.免標記適配體傳感器的制備及其用于8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷的檢測
　　基于8-OH-dG適配體Apt在8-OH-dG存在下的構(gòu)象變化制備了一種免標記的電化學(xué)生物傳感器，并用于8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷（8-OH-dG）的檢測。這種方法是將富鳥嘌呤（G）的適配體通過Au-S鍵自組裝到金電極表面，在8-OH-dG存在下，適配體的構(gòu)象從單鏈結(jié)構(gòu)變成緊密的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，阻礙帶負電荷的[Fe(CN)6]4-靠近

4、電極表面，使[Fe(CN)6]4-的氧化還原電流強度發(fā)生變化。利用循環(huán)伏安法和交流阻抗法對適配體傳感器的電化學(xué)行為進行了表征。實驗結(jié)果表明，該適配體傳感器的響應(yīng)電流與8-OH-dG的濃度在1.75 nM~3.675μM范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為0.315 nM(S/N=3)。該適配體傳感器有較高地穩(wěn)定性同時可以避免尿酸的強干擾。
　　2.基于非線性雜交鏈式反應(yīng)的超靈敏電化學(xué)生物傳感器的制備及其對DNA的檢測
　　基于非線性雜

5、交鏈式反應(yīng)（HCR）引發(fā)的DNA樹枝狀聚合物的鏈式增長，構(gòu)建了一種超靈敏的檢測平臺，實現(xiàn)了對特定序列 DNA的超靈敏檢測。當目標物 DNA（tDNA）存在時，tDNA引發(fā)非雜交鏈式反應(yīng)，最終自組裝形成樹枝狀的納米結(jié)構(gòu)。生物素標記的雜交鏈捕獲親和素修飾的辣根過氧化酶（HRP），HRP催化 H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），在一定程度上提高了電化學(xué)檢測信號。該檢測平臺實現(xiàn)了對tDNA的超靈敏檢測，檢出限為0.4 fM。

6、另外該傳感器具有較高的選擇性，能夠識別互補配對的DNA序列之間的單個堿基的差異。所以，該方法有可能在與基因有關(guān)的疾病的早期診斷中有較好的應(yīng)用前景。
　　3.基于非線性雜交鏈式反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器的制備及其對DNA的檢測
　　針對辣根過氧化酶（HRP）受反應(yīng)溫度等影響較大的問題，我們制備了一種新的基于非線性雜交鏈式反應(yīng)（HCR）吸附三氯化六銨合釕（RuHex）的電化學(xué)DNA傳感器，實現(xiàn)了對特定序列DNA的超靈敏檢測。當目標物

7、DNA（tDNA）存在時，tDNA引發(fā)非雜交鏈式反應(yīng)，最終自組裝形成樹枝狀的納米結(jié)構(gòu)。本實驗通過捕獲大量的具有電化學(xué)活性的RuHex，極大程度的提高了電化學(xué)檢測信號。該檢測平臺實現(xiàn)了對tDNA的超靈敏檢測，檢出限為0.33 fM。另外該傳感器具有較高的選擇性，能夠識別互補配對的DNA序列之間的單個堿基的差異。所以，該方法有望應(yīng)用在與基因有關(guān)的疾病的早期診斷中。
　　4.基于非雜交鏈式反應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備及其對DNA的檢

8、測
　　基于非線性雜化鏈式反應(yīng)（HCR）引發(fā)的DNA樹枝狀聚合物的鏈式增長，構(gòu)建了一種超靈敏的檢測平臺，實現(xiàn)了對特定序列 DNA的超靈敏檢測。當目標物 DNA（tDNA）存在時，tDNA引發(fā)非雜化鏈式反應(yīng)，最終自組裝形成樹枝狀的納米結(jié)構(gòu)。本實驗通過捕獲大量的具有電化學(xué)發(fā)光性能的吡啶釕（Ru(bpy)32+）在一定程度上提高了電化學(xué)檢測信號。該檢測平臺實現(xiàn)了對 tDNA的超靈敏檢測，實際的檢出限為10 fM。而且該檢測平臺具有較高的