丹參骨寶對醋酸潑尼松致骨丟失大鼠骨髓微循環(huán)及脂肪分化的影響.pdf

1、[目的]： 臨床上長期大劑量應用糖皮質激素(GC)可導致繼發(fā)性骨質疏松癥，其發(fā)病機理是綜合性因素，其中骨髓微循環(huán)改變和骨髓脂肪分化增強是糖皮質激素引起骨質疏松癥的重要機制。目前臨床上防治糖皮質激素性骨質疏松癥基本采用治療原發(fā)性骨質疏松癥的藥物。本實驗室開發(fā)研制的新藥丹參骨寶(其主要成分為丹參水溶性成分丹參素、丹參酚B、原兒茶醛)，前期研究發(fā)現其在防治糖皮質激素性骨質疏松方面具有肯定療效。為了進一步探討丹參骨寶的作用機制，本實驗應

2、用醋酸潑尼松建立大鼠骨丟失模型，通過觀察大鼠的骨組織形態(tài)計量學、骨密度，骨生物力學、骨髓微循環(huán)密度、骨髓基質干細胞PPARγ,的表達以及骨髓脂肪量等指標的變化，分析糖皮質激素誘發(fā)骨質疏松癥的骨髓調控機理，并觀察丹參骨寶是否對骨髓微循環(huán)改變和骨髓脂肪分化有影響，從而探討其防治糖皮質激素性骨質疏松癥作用機制，為從骨髓基質干細胞作為靶目標尋找有效對抗糖皮質激素性骨質疏松的藥物提供實驗依據。 [方法]： 6月齡SPF級雄性SD大

3、鼠64只，隨機分成8組，每組8只。基礎組(BAS)未用藥，在實驗開始即處死；對照組(CON)每R給予蒸餾水5ml/kg灌胃；低劑量丹參骨寶組(DSL)每日給予丹參骨寶提取物含5mg丹參素/5ml/kg灌胃：激素組(GC)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/5ml/kg灌胃；激素+羅蓋全組(GC+CAL)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/5ml/kg以及羅蓋全0.045ug/5ml/kg灌胃；激素+低劑量丹參骨寶組(GC+DSL)每日給

4、予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/5ml/kg以及丹參骨寶提取物含5mg丹參素/5ml/kg灌胃；激素+高劑量丹參骨寶組(GC+DSH)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/5ml/kg以及丹參骨寶提取物含10mg丹參素/5ml/kg灌胃；激素+丹參注射液組(GC+DSI)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/5ml/kg灌胃以及丹參注射液12ml/kg腹腔注射。以上藥物分為上下午兩次給藥，共計給藥時間為12w。所有動物在實驗結束前第14、13

5、d及第4、3d各行頸部皮下注射鈣黃綠素進行兩次熒光標記。用藥結束后心臟抽血處死大鼠，取血清行生化指標檢測，取腎上腺、脾臟、比目魚肌等計算器官指數，取左側股骨行脫鈣骨免疫組化染色，測定骨髓微循環(huán)密度(MVD)及PPARγ的表達量，取左側脛骨不脫鈣，行松質骨的骨形態(tài)計量學參數測量，取右側股骨行骨生物力學及骨密度檢測。 [結果]： 1.糖皮質激素對大鼠骨量、骨髓微循環(huán)和脂肪分化的影響(1)糖皮質激素可以導致大鼠骨丟失：醋酸潑尼

6、松以3.5mg/kg/d灌胃給藥方式作用12w后，大鼠脛骨上段松質骨骨小梁面積百分數比對照組下降43％(P<0.01)，骨小梁厚度下降23％(P<0.01)，而骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著增加，具有統計學意義。骨內膜面熒光周長百分數(％E-L.Pm)下降了50.7％，骨礦化沉積率(E-MAR)下降了36.3％，骨形成率(E-BFR/BS)下降了68.4％，均具有統計學意義(P<0.01)。同時我們觀察到大鼠體重增長明顯受抑制，免疫器官

7、指數下降，骨骼肌重量/體重比顯著下降。血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b含量明顯增高(P<0.05)，而堿性磷酸酶含量顯著降低(P<0.01)，并引發(fā)血清甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇以及血清葡萄糖含量升高(P<0.05)。 (2)糖皮質激素可以導致大鼠骨髓微循環(huán)密度(MVD)降低：在采甩vWF作為血管內皮標記物對血管進行免疫組化染色標記后，可清晰的看到模型組大鼠骨髓微血管呈現管腔狹窄、甚至閉合狀態(tài)，數量顯著減少，微循環(huán)密度降低，模型組

8、大鼠MVD比對照組降低約19％(P<0.05)，具有統計學意義。 (3)糖皮質激素可以導致大鼠骨髓基質干細胞PPARγ蛋白的表達量增加，骨髓脂肪面積增加：在對大鼠骨髓基質干細胞進行免疫組化PPARγ蛋白特異性染色后，我們發(fā)現模型組大鼠骨髓基質干細胞中PPARγ蛋白的表達量明顯增多，表現為細胞漿內蛋白著色顯著增強，用計算機LeicaQ550CW圖像分析系統進行灰度測定，模型組大鼠表達PPARγ蛋白的骨髓基質干細胞(陽性細胞)胞漿吸

9、光度顯著增強(P<0.01)，顯示糖皮質激素能夠促進骨髓基質干細胞的成脂分化，具有統計學意義。同時我們觀察到模型組大鼠骨髓腔中脂肪細胞明顯增多，脂肪面積增加，血竇被擠壓閉合。 2.丹參骨寶及羅蓋全、丹參注射液對大鼠骨量與骨髓微循環(huán)、脂肪分化的影響 (1)丹參骨寶對糖皮質激素致骨丟失大鼠的防治作用：低、高劑量丹參骨寶均可對抗糖皮質激素導致的大鼠脛骨上段松質骨骨小梁面積百分數(％Tb.Ar)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚

10、度(Tb.Th)的降低。激素+低劑量丹參骨寶組大鼠骨小梁面積百分數(％Tb.Ar)是激素組的176％(P<0.01)，并超過了對照組，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素組的124％(P<0.01)，接近對照組水平。骨內膜面％E-L.Pm是激素組的164.7％(P<0.01)，E-MAR是激素組的137.1％(P<0.05)，E-BFR/BS是激素組的220.4％(P<0.01)。激素+高劑量丹參骨寶組大鼠骨小梁面積百分數(％Tb.Ar)是激

11、素組的220％(P<0.01)，并超過了對照組，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素組的149％(P<0.01)，超過了對照組。骨內膜面％E-L.Pm是激素組的191％(P<0.01)，E-BFR/BS是激素組的246.6％(P<0.01)，尚未達到對照組水平。并且低、高劑量丹參骨寶組大鼠的骨小梁分離度(Tb.Sp)較激素組均顯著下降，具有統計學意義。同時丹參骨寶可顯著對抗糖皮質激素抑制大鼠體重增長的作用，高劑量丹參骨寶可有效改善糖皮質激素所

12、致的免疫器官萎縮現象，并可增加下肢骨骼肌的相對重量(P<0.01)。 激素+低劑量丹參骨寶組大鼠骨髓微循環(huán)密度顯著增高，是激素組的120％(P<0.05)，并且觀察到血管腔多呈開放擴張狀態(tài)，同時骨髓腔脂肪面積明顯減小，骨髓基質干細胞中PPARγ,蛋白的表達量也有所減少，陽性細胞吸光度減弱。激素+高劑量丹參骨寶組大鼠骨髓微循環(huán)密度顯著增高，是激素組的132％(P<0.01)，血管明顯擴張，血細胞充盈。骨髓腔脂肪面積顯著減少，骨髓基

13、質干細胞中PPARγ,陽性細胞吸光度明顯減弱，具有統計學意義。丹參骨寶在改善骨髓微循環(huán)，逆轉骨髓基質干細胞成脂分化方面顯示出突出的作用。 (2)羅蓋全、丹參注射液對糖皮質激素致骨丟失大鼠的防治作用：激素+羅蓋全組大鼠脛骨上段松質骨骨小梁面積百分數(％Tb.Ar)是激素組的209％(P<0.01)，并超過了對照組，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素組的117％(P<0.05)，骨小梁分離度(Tb.Sp)較激素組顯著下降(P<0.01)

14、，并顯著低于對照組。該組％E-L.Pm、E-MAR、E-BFR/BS三項動態(tài)參數均顯著高于激素組(P<0.01)。但羅蓋全并沒有改善骨髓微循環(huán)狀況，與激素組相比，兩組大鼠骨髓腔中微循環(huán)密度無顯著性差異，羅蓋全組大鼠骨髓腔微循環(huán)擴張不明顯，并且該組大鼠骨髓基質干細胞表達PPARγ,蛋白仍較強，顯示羅蓋全未能逆轉骨髓基質干細胞的成脂分化增多現象。 激素+丹參注射液組大鼠脛骨上段松質骨骨小梁面積百分數(％Tb.Ar)比激素組稍有所增加

15、，但不具有統計學意義，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素組的127％(P<0.05)，骨小梁分離度(Tb.Sp)與激素組相比無顯著性差異，脛骨上段骨內膜面動態(tài)參數與激素組相比差異不大，丹參注射液未能顯著對抗糖皮質激素抑制骨形成作用。并且該組大鼠骨髓基質干細胞表達PPARγ蛋白仍較強，顯示出丹參注射液未能顯著對抗糖皮質激素導致的骨髓基質干細胞成骨減少、成脂增多。而該組大鼠骨髓腔中微循環(huán)密度顯著增加(P<0.05)，微血管明顯擴張。 [

16、結論]： 1.本研究表明糖皮質激素顯著影響大鼠骨質及骨髓微循環(huán)和骨髓基質干細胞的成脂、成骨分化。其結果是明顯減少大鼠松質骨骨小梁面積百分數，骨小梁厚度及骨小梁數量，增加了骨小梁分離度，并顯著降低了骨內膜面熒光周長百分數、骨礦化沉積率和骨形成率，同時引起骨髓腔微循環(huán)障礙，微血管閉合，微循環(huán)密度降低，而骨髓基質干細胞表達PPARγ蛋白顯著增強，骨髓脂肪面積明顯擴大。因此推論，大劑量長期使用糖皮質激素導致骨質疏松癥的主要機制，可能為激

17、素誘導骨髓基質干細胞成脂分化增多、微循環(huán)障礙，進一步導致成骨小梁骨形成減少，骨量降低，最終導致骨質疏松。 2.丹參骨寶明顯改善骨髓微循環(huán)，增加微循環(huán)密度，擴張血管，并且有效減弱骨髓基質干細胞PPARγ蛋白的表達，抑制其成脂，促進成骨，顯著增加骨量，在對抗糖皮質激素所致大鼠骨丟失方面具有顯著防治作用。羅蓋全能夠有效增加松質骨骨小梁，但不能改善骨髓微循環(huán)，未能逆轉骨髓基質干細胞的成脂分化增多現象。丹參注射液能夠有效改善骨髓微循環(huán)，但