放線菌素D誘導(dǎo)V79細(xì)胞旁觀者效應(yīng)及其機(jī)制和旁觀者因子篩選的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：旁觀者效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)由來(lái)已久，但研究幾乎都集中在α粒子、中子、γ射線、X射線等高能量的電離輻射所誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)(bystander effect，BE)上，對(duì)于非電離輻射的其他理化因素所誘導(dǎo)的BE報(bào)道較少。2002年，Xiao等首次報(bào)道UVA可誘發(fā)旁觀者效應(yīng)；而且UVA照射后，瀕死細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液(conditionmedium，CM)也能誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)。該結(jié)果提示除電離輻射外，非電離輻射等其他理化因素也有引起B(yǎng)E的能力。由于BE

2、是原有損害效應(yīng)的延續(xù)與放大，其毒理學(xué)意義受到人們的廣泛關(guān)注。
　　 而化學(xué)因素引起靶細(xì)胞的DNA損傷誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)的相關(guān)研究很少。直到近幾年才有三篇關(guān)于烷化劑的研究，發(fā)現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)也可能誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)。但其他化學(xué)毒物(遺傳物質(zhì)損傷劑等)是否能引起旁觀者效應(yīng)及其特征尤其是發(fā)生機(jī)制的研究幾乎還是一片空白。旁觀者效應(yīng)的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚，經(jīng)由不同途徑死亡的靶細(xì)胞所產(chǎn)生和釋放的旁觀者因子的性質(zhì)更沒(méi)有確定。
　　 本課題主要就化學(xué)

3、物角度，首次采用經(jīng)典的致凋亡物質(zhì)放線菌素D(Actino-mycin，ActD)來(lái)制作靶細(xì)胞DNA損傷凋亡模型，來(lái)研究旁觀者效應(yīng)情況及其發(fā)生機(jī)制，并對(duì)旁觀者因子進(jìn)行篩選。
　　 1、用不同劑量ActD處理V79細(xì)胞不同時(shí)間，觀察各指標(biāo)變化，確定最適的條件來(lái)建立靶細(xì)胞凋亡模型，為后續(xù)研究靶細(xì)胞在凋亡過(guò)程中能否產(chǎn)生和釋放引起旁觀者效應(yīng)的因子以及效應(yīng)因子的性質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)資料。
　　 2、利用ActD所致V79細(xì)胞凋亡模型，取

4、不同時(shí)段靶細(xì)胞去細(xì)胞培養(yǎng)液CM，培養(yǎng)旁觀者細(xì)胞，以存活率、死亡方式、染色體畸變、超微結(jié)構(gòu)改變?yōu)闄z測(cè)終點(diǎn)，確定凋亡進(jìn)程中CM是否能夠誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)及效應(yīng)最強(qiáng)時(shí)段，為闡明DNA損傷類(lèi)型(凋亡)與旁觀者效應(yīng)之間的關(guān)系提供重要線索，為篩選旁觀者因子打下基礎(chǔ)。
　　 3、采用CM培養(yǎng)旁觀者細(xì)胞，觀察不同時(shí)段CM對(duì)DNA損傷反應(yīng)和凋亡關(guān)鍵基因p53，Bax，Bcl-2的表達(dá)水平。同時(shí)檢測(cè)ROS水平、細(xì)胞周期及線粒體膜電位(△Ψm)變化，推測(cè)

5、線粒體通路在導(dǎo)致旁觀者細(xì)胞凋亡中的作用及其他可能通路的情況。為研究化學(xué)因素誘導(dǎo)旁觀者細(xì)胞凋亡機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與資料。
　　 4、將旁觀者效應(yīng)最強(qiáng)的4h時(shí)段CM與對(duì)照組CM進(jìn)行2D電泳，應(yīng)用MALDI-TOF MS進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分析，以篩選和鑒定可能存在的旁觀者因子。為確證旁觀者效應(yīng)發(fā)生的確切機(jī)制提供重要資料和線索。
　　 方法：
　　 1、ActD所致V79靶細(xì)胞凋亡模型的建立
　　 (1)細(xì)胞及培養(yǎng)

6、中國(guó)倉(cāng)鼠成纖維細(xì)胞V79-C3細(xì)胞株(購(gòu)自北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)。細(xì)胞株于含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天傳代。
　　 (2)細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入不同劑量ActD(0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/L)處理細(xì)胞(0.5，1，2，4h)。用PBS洗3次，加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24h：
　　 MTT法酶標(biāo)儀上測(cè)細(xì)胞存活率；
　　 A

7、nnexin V-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡/壞死率；
　　 相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)；
　　 染色體畸變分析檢測(cè)靶細(xì)胞染色體損傷；
　　 Hoechst33258染色；Annexin V-FITC/PI雙染，熒光顯微鏡下觀察凋亡情況；
　　 透射電子顯微鏡觀察靶細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 2、ActD處理V79細(xì)胞后CM誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　 (1)不同時(shí)段去靶細(xì)

8、胞培養(yǎng)液(CM)的獲取以4mg/LActD處理1h作為計(jì)時(shí)的起點(diǎn)，分別在第4h、8h、12h和24h取細(xì)胞培養(yǎng)液0.22μm濾器過(guò)濾后加入到正常的V79-C3細(xì)胞(旁觀者細(xì)胞)中，再培養(yǎng)24h后，進(jìn)行旁觀者效應(yīng)的觀察。
　　 (2)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)到75%融合時(shí)分別加入不同時(shí)段(4h、8h、12h、24h)去細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，觀察指標(biāo)與靶細(xì)胞相似：
　　 相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)并拍照。
　　 MTT法測(cè)定細(xì)

9、胞存活率。
　　 常規(guī)的染色體畸變分析方法制片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察染色體損傷。
　　 AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 3、ActD所致V79細(xì)胞旁觀者效應(yīng)機(jī)制的研究
　　 (1)RT-PCR方法檢測(cè)p53、Bcl-2、Bax mRNA水平將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的正常細(xì)胞加入不同時(shí)段(4h、8h、12h、24h)CM培養(yǎng)2

10、4h，加入設(shè)計(jì)的各引物，RT-PCR方法檢測(cè)p53、Bcl-2、Bax mRNA水平。
　　 (2)蛋白測(cè)定將處理后的細(xì)胞爬片丙酮固定，參照SABC試劑盒免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)旁觀者細(xì)胞p53蛋白表達(dá)；對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的正常細(xì)胞加入不同時(shí)段(4h、8h、12h、24h)CM培養(yǎng)24h，Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　 (3)細(xì)胞周期測(cè)定方法對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的正常細(xì)胞加入不同時(shí)段(4h

11、、8h、12h、24h)CM培養(yǎng)24h，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。計(jì)算G0/G1期，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)。
　　 (4)流式細(xì)胞儀測(cè)定旁觀者細(xì)胞ROS和線粒體膜電位(△Ψm)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的正常細(xì)胞加入不同時(shí)段(4h、8h、12h、24h)CM培養(yǎng)24h，2’，7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)熒光染色檢測(cè)ROS活力；Rh123(Rhodamine123)熒光染色檢測(cè)線粒體膜電位(△Ψm)。
　　 (5)細(xì)胞色

12、素C含量測(cè)定采用改良的張均田法測(cè)定。細(xì)胞處理結(jié)束后，分別收集線粒體和胞質(zhì)。取待測(cè)樣品，加少許連二亞硫酸鈉，520nm比色。
　　 4、旁觀者因子的篩選
　　 (1)樣品的制備樣品超濾濃縮，沉淀室溫干燥，加入裂解液，Bradford法測(cè)蛋白濃度，-80℃保存。
　　 (2)2D電泳、染色、差異蛋白點(diǎn)比對(duì)第一向等電點(diǎn)聚焦，第二向SDS-PAGE電泳，硝酸銀染色。凝膠用圖像掃描儀掃描，選擇正常對(duì)照組CM蛋白質(zhì)的凝膠圖像

13、作為參考膠，旁觀者效應(yīng)最強(qiáng)時(shí)段組CM凝膠圖像與之進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)分析采用ImageMaster2D Elite4.O1軟件。
　　 (3)差異蛋白質(zhì)的MALDI-TOF質(zhì)譜分析將銀染凝膠膠內(nèi)原位酶解，MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀進(jìn)行一級(jí)二級(jí)質(zhì)譜，肽質(zhì)量指紋圖譜分析，鑒定蛋白質(zhì)。
　　 (4)肽質(zhì)量指紋圖譜的數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)將MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜分析得到的數(shù)據(jù)(肽片段質(zhì)量)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，從而鑒定蛋白。
　　

14、 5、數(shù)據(jù)處理
　　 使用SPSS11.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用單向方差分析(ANOVA)，LSD法進(jìn)行兩兩比較；計(jì)數(shù)資料用X2檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1、MTT法檢測(cè)ActD對(duì)靶細(xì)胞存活率的影響，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，流式細(xì)胞儀分析均發(fā)現(xiàn)4.0mg/L處理1h時(shí)細(xì)胞凋亡率最高壞死率較低達(dá)到建立V79細(xì)胞凋亡模型的目的。同時(shí)，用熒光染色和透射電鏡觀察也證實(shí)了在該條件下

15、細(xì)胞的改變主要是凋亡。而且染色體畸變實(shí)驗(yàn)也表明ActD是一種DNA損傷劑，可以引起V79細(xì)胞的染色體畸變。
　　 2、觀察不同時(shí)段CM所致旁觀者效應(yīng)。細(xì)胞形態(tài)、存活率及染色體分析顯示4hCM誘導(dǎo)旁觀者細(xì)胞損傷的作用最強(qiáng)。隨后逐漸減輕，24h時(shí)段又趨嚴(yán)重。凋亡率與之一致且與靶細(xì)胞一樣死亡方式主要是凋亡。電鏡觀察各CM組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯，4hCM處理組最重。各指標(biāo)24h時(shí)段反彈現(xiàn)象可能是由于旁觀者因子累積效應(yīng)。
　　 3、研

16、究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CM組p53mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均比對(duì)照組升高，與旁觀者細(xì)胞凋亡率的變化一致，提示ActD誘導(dǎo)的旁觀者細(xì)胞凋亡可能是p53介導(dǎo)的。旁觀者細(xì)胞出現(xiàn)了G1期阻滯，Bax mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)增加，Bcl-2mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)下降，線粒體膜電位(△Ψm)下降，CytC釋放增加，均說(shuō)明p53通過(guò)線粒體途徑參與了旁觀者細(xì)胞的凋亡。且CM處理組ROS水平增加，提示氧化損傷途徑可能也參與了旁觀者細(xì)胞的凋亡。故我們推測(cè)p53-Bcl-

17、2、Bax-CytC-caspase3(即線粒體通路)途徑在導(dǎo)致ActD的CM引起旁觀者細(xì)胞凋亡中起重要的主導(dǎo)作用。
　　 4、用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選旁觀者因子發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組CM與對(duì)照組存在蛋白差異點(diǎn)，TPXⅡ明顯降低。但尚需采用其它方法如檢測(cè)其mRNA及蛋白水平對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 結(jié)論：
　　 1、ActD可以引起V79細(xì)胞染色體的損傷，是一種V79細(xì)胞的化學(xué)誘變劑。其制作凋亡模型的最適劑量和時(shí)間為：4.

18、0mg/L作用1h。
　　 2、凋亡過(guò)程中的去靶細(xì)胞培養(yǎng)液(CM)可以誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)。產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)的最強(qiáng)時(shí)段為4h。旁觀者細(xì)胞的死亡方式與靶細(xì)胞一樣也以凋亡為主。24h時(shí)段反彈現(xiàn)象說(shuō)明可能存在旁觀者因子累積效應(yīng)。
　　 3、p53可能通過(guò)線粒體途徑介導(dǎo)了旁觀者細(xì)胞的凋亡。CM處理組ROS水平增加，提示氧化損傷途徑也可能參與了旁觀者細(xì)胞的凋亡或者旁觀者效應(yīng)。
　　 4、質(zhì)譜分析顯示實(shí)驗(yàn)組CM與對(duì)照組CM存在蛋白差