核轉錄因子Nrf-1在脂肪細胞侵華及砷致胰島素抵抗中的作用.pdf

1、目的：脂肪細胞在能量儲存和代謝中發(fā)揮著重要的作用，由其所分泌的不同因子具有影響食欲、胰島素敏感性、炎癥反應以及其他生物學通路的作用，具有重要臨床意義。肥胖，是慢性代謝綜合癥的主要病因之一，機體通常處于慢性氧化應激和炎癥狀態(tài)。然而，活性氧在肥胖的發(fā)生發(fā)展中的作用卻一直不清。核轉錄因子NE-E2相關因子(Nrfs)是啟動抗氧化反應元件的轉錄因子，屬于CNC家族的堿性亮氨酸拉鏈蛋白。在本研究組最新的研究中已證實，Nrf2可以通過調控PPARγ

2、的表達而影響脂肪細胞的形成過程，鑒于Nrf1在結構以及在調控抗氧化酶基因等功能上與Nrf2的相似，以及在不同器官中的獨特作用，我們認為其在調控脂肪細胞分化過程中極可能存在與Nrf2相似的功能。因此，我們用含有針對小鼠Nrf1基因的sh-RNA慢病毒，感染小鼠3T3-L1前脂肪細胞系，建立小鼠Nrf1基因沉默的前脂肪細胞系，并進一步研究該基因在脂肪細胞分化和脂肪代謝過程中的作用。
　　 砷及其化合物是國際癌癥研究機構(IARC)確

3、認的人類致癌物。長期飲用高砷水除可導致砷性皮膚損傷及皮膚癌、內臟腫瘤、心血管疾病外，近年來的流行病學發(fā)現(xiàn)，砷中毒還可以導致糖尿病的高發(fā)。那么，低濃度砷長期暴露是否可以導致成熟脂肪細胞胰島素敏感性下降，即胰島素抵抗，目前，還沒有相關機制研究。因此，在本研究中，我們試圖探討低濃度的砷是否可以通過對Nrf1或Nrf2的調控而激活抗氧化酶，進而抑制胰島素刺激脂肪細胞糖攝取所依賴的ROS信號傳導通路，而導致胰島素抵抗。
　　 方法：

4、>　　 1、研究對象
　　 1)細胞培養(yǎng)
　　 小鼠3T3L1前脂肪細胞系購至ATCC。培養(yǎng)時應用含有10％小牛血清(CS)、50 units/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2，95％大氣條件下培養(yǎng)。
　　 2)細胞分化
　　 分化誘導劑為：地塞米松(Dexamethasone，簡寫為Dex)、異丁基甲基黃嘌呤(Isobutylmethylxanthine，簡寫

5、為IBMX)和胰島素(Insulin)，上述三者組合而成的誘導劑簡稱為“DMI”。此外，為加快細胞的分化速度，還可以向DMI中補充添加羅格列酮(Rosiglitazone，簡寫為Rosi)和吲哚美辛(Indomethacin，簡寫為Indo)。上述五種誘導劑的組合可簡稱為“DMIRI”或“All”。含有分化誘導劑的培養(yǎng)基稱為“分化培養(yǎng)基”。
　　 2、建立Nrf1沉默的3T3L1細胞系MISSION短發(fā)卡RNA(shRNA)慢病

6、毒顆粒購于Sigma。按產品手冊將針對基因Nrf1(SHVRS-NM-008686)或非針對性的Scramble陰性對照(Scr，SHC002V)的顆粒轉導至小鼠3T3L1前脂肪細胞系。轉導前24小時，細胞以40-50％的融合率被接種于6孔板。次日，以每孔8μg/ml和2×105TU(Transducing Units，傳導單位)的濃度向細胞中分別添加海美溴銨(Hexadimethrine bromide)和病毒顆粒。隔夜孵育后，將含有

7、病毒顆粒的培養(yǎng)基換為含有2μg/ml嘌呤霉素(Puromycin)的新鮮培養(yǎng)基，對細胞進行篩選，建立Nrf1基因沉默和Scr穩(wěn)定傳染的細胞模型。待細胞達到90％融合后，用含有puromycin的培養(yǎng)基將其傳代。其中，在進行傳導實驗之前，先確定于3-5天內可將全部細胞殺死的puromycin的濃度。
　　 3、油紅染色(Oil-red Stainning)油紅染色步驟如下：將細胞培養(yǎng)基棄去，冷PBS沖洗細胞3次，于10％中性緩沖福

8、爾馬林(10％neutral-buffered formalin)中固定5分鐘，冷PBS再次沖洗細胞3次，并于搖床上連續(xù)沖洗5分鐘，其間換液2次。棄去PBS后于油紅染料中染色30分鐘，而后用PBS再次沖洗細胞，上掃描儀掃描。
　　 4、蛋白提取、定量與Western Blot免疫印跡法(Western blot)檢測上述基因的蛋白表達情況：收集細胞、裂解細胞后，提取總蛋白。核蛋白提取按照試劑盒說明書進行，提取后置于-80℃保存。

9、調整總蛋白或核蛋白濃度一致，進行蛋白電泳。蛋白電泳后，將蛋白轉印到PVDF膜上，封閉后分別加入適當比例稀釋的一抗雜交，然后加入各自相應的二抗再次雜交。
　　 5、mRNA提取與定量Real-time PCR分析應用TRIzol(invitrogen)法進行細胞總mRNA提取。定量Real time PCR操作方法主要步驟如下，逆轉錄反應：總RNA經MuLV反轉錄酶和OligodT，dNTP轉錄為cDNA。充分混合后，首先經25℃

10、，10 min；48℃，60 min合成cDNA，然后于95℃加熱5min，終止反應，4℃?zhèn)溆?。使用SYBR Green試劑盒(Applied Biosystem)進行Real-time PCR分析。
　　 6、急性細胞毒性檢測(MTT)細胞按每孔5×104濃度接種于96孔板內，置于細胞培養(yǎng)箱內貼壁24小時，之后倒掉培養(yǎng)液，用含有不同濃度亞砷酸鈉(5-50μM)的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24或48小時，之后用非放射活性細胞增值試劑盒(

11、G5430，美國Promega公司)檢測細胞活力，結果用砷暴露組與對照組(不含砷的培養(yǎng)液)的百分比表示，同時制作細胞活性線性圖形，并記錄LC50(細胞的半數致死劑量)。比較3T3L1細胞Nrf1基因沉默對砷誘導細胞毒性的反應。
　　 7、胰島素敏感性實驗AKT磷酸化實驗(pAKT-Ser407)與[3H]-2-脫氧葡萄糖攝取([3H]-2-deoxy-D-glucose uptake)實驗被用于亞砷酸鈉處理的成熟脂肪細胞的胰島素

12、敏感性實驗。
　　 8、細胞內GSH表達水平的測定應用BIOXYTECH GSH/GSSG-412試劑盒(Oxis Research)進行總GSH(Glutathione)與GSSG(Glutathion disulfide)分析。
　　 9、統(tǒng)計與分析應用統(tǒng)計軟件Graphpad Prism5進行數據處理分析與制圖。用單因素方差分析(ANOVA)比較各組之間的統(tǒng)計學差異，所有實驗結果均來自3個以上平行樣品或3次以上重復

13、實驗，以P<0.05表示統(tǒng)計學差異顯著。
　　 結果：
　　 1、建立Nrf1基因沉默小鼠3T3L1前脂肪細胞系Real time-PCR結果顯示成功建立了Nrf1全型和長型基因沉默的sh-Nrf1-A細胞系與sh-Nrf1-L細胞系。
　　 2、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細胞抗氧化酶基因表達分析對sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細胞抗氧化酶基因表達進行分析，Nrf1全型基因沉默可以顯著降低細胞

14、中Gclc、Gclm、Nqo1的基因的表達，而不改變HO1的表達：Nrf1長型基因沉默可以降低Gclc、Nqo1的基因的表達，而不改變Gclm、HO1的表達。
　　 3、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細胞急性細胞毒性實驗經5-50μM和5-35μM亞砷酸鈉染毒24、48小時后，3種細胞活力均隨著亞砷酸鈉濃度的增高而逐漸變低，其中Nrf1基因沉默細胞(sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細胞)對砷暴露表現(xiàn)出敏感性。

15、>　　 4、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細胞Nrf1蛋白表達Western結果顯示Nrf1全型和長型基因沉默的sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細胞系相應的被沉默的Nrf1蛋白，表達均顯著降低。
　　 5、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細胞脂肪細胞分化相關基因的表達分析sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細胞的Cebpα、δ、Pparγ、Pparγ1和Pparγ2的基因表達均高于對照Scramble細胞

16、、sh-Nrf1-A細胞的Cebpβ的基因表達高于對照Scramble細胞。
　　 6、Nrf1基因沉默3T3L1細胞的分化能力油紅染色顯示，Nrf1全型和長型基因沉默的sh-Nrf1-A細胞系與sh-Nrf1-L細胞系分化能力增強。
　　 7、sh-Nrf1-L細胞分化7天、24小時和8小時過程中脂肪細胞分化相關基因與蛋白的變化Real time-PCR與Western結果顯示sh-Nrf1-L細胞分化7天、24小時和

17、8小時過程中，其Pparγ的表達均高于Scramble對照細胞。
　　 8、長期砷暴露對脂肪細胞葡萄糖攝取的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可降低成熟脂肪細胞胰島素刺激的葡萄糖攝取，并呈現(xiàn)時間、劑量-效應。
　　 9、砷致脂肪細胞ROS的產生長期低劑量亞砷酸鈉暴露可增加成熟脂肪細胞內ROS的產生，并呈現(xiàn)劑量-效應。
　　 10、砷致脂肪細胞抗氧化基因與蛋白的表達長期低劑量亞砷酸鈉暴露可增加成熟脂肪細胞內多種抗氧化酶的基

18、因和蛋白水平的表達，并呈現(xiàn)劑量-效應關系。
　　 11、長期砷暴露對脂肪細胞GSH含量的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露不改變成熟脂肪細胞內GSH的含量。
　　 12、長期砷暴露對脂肪細胞Nrf1與Nrf2基因與蛋白表達的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可以增加Nrf2基因與蛋白的表達，而不改變Nrf1基因的表達，并降低Nrf1蛋白的表達。
　　 13、長期砷暴露對脂肪細胞分化與炎性介質基因表達的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可

19、以降低Cebpα、Pparγ1和Pparγ2的基因表達，并增高炎性介質Tnf-α、IL-6、IL-1β、iNos和Cox-2的基因表達。
　　 14、長期砷暴露對脂肪細胞IRS-1-p-AKT通路的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可以增強基礎水平的p-IRS1-Ser307和p-AKT-Ser473蛋白的表達，降低基礎水平的p-PI3K的蛋白表達，使成熟脂肪細胞的胰島素敏感性下降。
　　 15、長期砷暴露對脂肪細胞Glut1與

20、Glut4 mRNA表達的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露不改變基礎水平的Glut1基因表達，而降低Glut4表達。
　　 結論：
　　 1、成功獲得Nrf1全型和長型基因沉默的小鼠3T3L1前脂肪細胞模型，且核轉錄因子Nrf1參與調控抗氧化酶和分化相關基因的表達。
　　 2、Nrf1基因沉默可通過提高前脂肪細胞中Pparγ的表達而增強分化。
　　 3、長期低劑量亞砷酸鈉暴露通過提高抗氧化酶的表達而抑制胰島素刺