青蒿琥酯對小鼠造血干-祖細胞的毒性機制研究.pdf

1、青蒿素（arteannuin）是1971年由我國科學家從菊花科植物黃花蒿（Artemisia annua Linn）中提取而來的一種天然的倍半萜內過氧化合物。經多方面的研究證實，它是一種非常有效的抗瘧藥二氫青蒿素（dihydroartemisinin）的前體。根據其研發(fā)的第一代藥物為半合成的乙縮醛類青蒿素衍生物，其中包括蒿甲醚（artemether）、蒿乙醚（arteether）、青蒿琥酯（artesunat）等等。它們在體內均代謝成為

2、二氫青蒿素，臨床上主要用于抗瘧治療。青蒿琥酯為水溶性，與其它同類的藥物相比其抗瘧作用不但療效快、毒性小，而且劑型多樣，給藥方便，因此被廣泛應用于惡性瘧治療和危重的腦型瘧搶救。近年來國內外學者對青蒿琥酯的藥理活性進行了廣泛的研究，發(fā)現其還具有抗腫瘤、抗病毒、抗纖維化、抗高血壓、抗血吸蟲、調節(jié)免疫等諸多藥理活性，尤其是其抗腫瘤作用研究目前正備受矚目。 與此形成鮮明對比的是，目前涉及其毒理學作用機制的研究深度卻十分有限。誠然，青蒿素衍

3、生物在實際臨床治療過程中的毒副作用不太常見，對孕婦也相當安全，且目前的研究也沒有明確的證據證明其具有嚴重的副作用。但是在動物研究中，大劑量青蒿素衍生物可明確表現出神經系統(tǒng)毒副作用和一過性的造血系統(tǒng)抑制現象。國內外學者通過研究初步證實其毒副作用機制與其藥理活性具有緊密聯系，使其在發(fā)揮藥理活性過程中殺傷‘敵人’的同時也將造成機體的損傷。從其作用機制推測，青蒿素類藥物毒副作用產生的最大原因可能在于其所具有的特殊的分子結構。它被鐵離子活化后可釋

4、放出各種活性氧簇reactive oxygen species，ROS），產生自由基特異性或非特異性地損傷各種細胞結構，其中包括細胞的遺傳物質DNA、各種維持機體正常機能的關鍵蛋白質、以及維持細胞活性所必需的各種膜類結構和線粒體。除此之外，青蒿琥酯還可通過上調或下調某些功能基因的表達引致細胞正常生理功能紊亂使機體致病。但目前對該類藥物的基本毒性作用環(huán)節(jié)、作用靶標，具體作用方式仍不甚明了，這將嚴重阻礙青蒿素類藥物臨床應用的拓展。

5、為明確了解青蒿素類藥物具體的造血毒性作用環(huán)節(jié)及機制，本課題決定選擇水溶性青蒿素衍生物青蒿琥酯作用為研究對象。主要采用小鼠骨髓造血干細胞體外培養(yǎng)作為研究手段，運用多種先進的細胞生物學、分子生物學研究方法進行探索，以期初步闡釋青蒿琥酯對造血干細胞的各種毒理學影響，并由此進一步找出其具體的作用靶點，為該類藥物不斷應用拓展打下基礎。 方法： 1．骨髓造血干細胞的培養(yǎng)與鑒定。 取小鼠骨髓造血干細胞進行半固體培養(yǎng)，添加適量E

6、PO（促紅細胞生成素）誘導其定向分化為紅系造血祖細胞，取造血祖細胞進行聯苯胺染色鑒定。 2．青蒿琥酯對造血干細胞定向分化的抑制作用。 取小鼠骨髓造血干細胞進行半固體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進行干預，其中設一個溶劑對照組；光鏡下計數紅系集落形成單位（CFU-E）和紅系爆式集落形成單位（BFU-E）。 3．青蒿琥酯對細胞內鐵代謝的影響。 取小鼠骨髓造血干細胞進行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯

7、藥物進行干預，其中設一個溶劑對照組；分別于培養(yǎng)過程中的24h、48h、72h取出細胞進行鐵染色，光鏡下計數出現鐵顆粒的細胞數量及細胞內鐵顆粒的數目。 4．青蒿琥酯對小鼠造血干細胞DNA的損傷作用。 取小鼠骨髓造血干細胞進行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進行干預，其中設一個溶劑對照組和一個H2O2陽性對照組；通過單細胞電泳檢測、熒光顯微鏡下計數出現彗尾現象的細胞數目，評估拖尾程度。 5．凝膠電泳檢測造血干

8、/祖細胞的凋亡。 取小鼠骨髓造血干細胞進行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進行干預，其中設一個溶劑對照組，分別于藥物干預12h、24h后提取細胞DNA作凝膠電泳檢測。 6．流式細胞術檢測青蒿琥酯誘導的細胞凋亡。 取小鼠骨髓造血干細胞進行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進行干預，其中設一個溶劑對照組，分別于藥物干預72h后進行流式細胞術檢測。 7．流式細胞術檢測青蒿琥酯對骨髓造血干細胞線粒體

9、膜電位的影響。 取小鼠骨髓造血干細胞進行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進行干預，其中設一個溶劑對照組，于藥物干預12h后進行流式細胞術檢測細胞線粒體膜電位。 8．電鏡觀察青蒿琥酯誘導的線粒體結構損傷與細胞形態(tài)學變化。 取小鼠骨髓造血干細胞進行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進行干預，其中設一個溶劑對照組，于藥物干預12h后固定液固定，透射電鏡觀察細胞形態(tài)學和線粒體的改變。 9．ALAS活

10、性的測定。 取成年大鼠肝臟線粒體加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進行干預，通過核酸蛋白檢測儀測定NADH的吸光度（OD值）。 結果： 1．骨髓造血干細胞的培養(yǎng)與鑒定。 造血干細胞分別經過半固體或液體培養(yǎng)，并進行定向誘導分化后的觀察結果如下：半固體定向培養(yǎng)細胞在倒置顯微鏡下觀察，紅系集落背景稍暗，集落內細胞圓整，體積較小，細胞間緊密連接，因為細胞漿內有血紅素合成，集落可呈黃色或紅色。液體定向培養(yǎng)細胞在倒置顯微鏡下

11、觀察，紅系集落背景稍暗，集落內細胞圓整，體積較小，細胞間連接較緊密，但比半固體培養(yǎng)集落松散，沉積于瓶底，不貼壁，集落周邊有散在的形態(tài)類似的集落脫落細胞，集落可呈黃色或紅色，也可無色。紅系造血祖細胞鑒定：細胞經聯苯胺與蘇木素復染后胞漿呈紅褐色，胞核呈紫藍色。 2．青蒿琥酯對小鼠造血干細胞分化和抑制作用。 半固體定向培養(yǎng)的造血干細胞受藥物干預的結果表明，青蒿琥酯能明顯抑制造血干細胞向紅系造血祖細胞分化，并具有劑量依賴性關系，

12、兩個最大劑量組與溶劑對照組比較具有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。 3．青蒿琥酯對細胞內鐵代謝的影響。 經藥物干預的液定向體培養(yǎng)的造血干細胞進行鐵染色結果表明，細胞內有鐵粒沉積現象，并具有劑量依賴性關系；細胞內沉積的鐵粒絕大部分只1～2個，為Ⅰ型沉積；各藥物組與溶劑對照組比較均具有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。 4．青蒿琥酯對小鼠造血干細胞DNA的損傷作用。 經單細胞電泳實驗發(fā)現，H2O2陽性對照組細胞可見較明

13、顯的慧尾，陰性對照組基本無慧尾出現，各藥物組細胞均出現不同程度的慧尾現象，但不如陽性對照組表現明顯，多為輕度損傷。 5．凝膠電泳檢測造血干/祖細胞的凋亡現象。 凝膠電泳檢測結果顯示：不同劑量的青蒿琥酯（0．01mmol/L～2．60mmol/L）均可誘導骨髓造血干/祖細胞凋亡，凋亡條帶主要分布于500bp至2000bp之間。 6．流式細胞術檢測青蒿琥酯誘導的細胞凋亡現象。 流式細胞儀檢測發(fā)現：青蒿琥酯用藥

14、72h后可引起細胞晚期凋亡/死亡，各用藥組與溶劑對照組比較均具有統(tǒng)計學意義（P=0．000）；雙變量相關分析表明青蒿琥酯劑量與細胞晚期凋亡/死亡率呈正相關（Spearman's：r=0．960，P=0．000）。 7．流式細胞術檢測藥物對線粒體膜電位（MMP）的影響。 流式細胞儀檢測發(fā)現：青蒿琥酯可引起造血干/祖細胞MMP顯著下降（LSDt-tests各組比較均為P<0．05），且MMP下降程度具有劑量依賴關系；雙變量相

15、關分析也表明青蒿琥酯劑量與MMP變化之間呈正顯著相關（r=0．546，P=0．018）。 8．電鏡觀察青蒿琥酯誘導的線粒體結構損傷與細胞形態(tài)學變化。 電鏡觀察結果表明：藥物作用后造血干細胞后可見典型的細胞凋亡形態(tài)學改變；線粒體出現不同程度的破壞，主要表現為線粒體腫脹，嵴結構模糊或消失，或呈空泡樣改變。 9．ALAS活性的測定。 核酸蛋白檢測儀測定NADH吸光度，結果表明青蒿琥酯能明顯增強ALAS的活性，且