血小板TLR4在LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細胞損傷中作用機制的體外研究.pdf

1、膿毒癥（sepsis）是指各種致病微生物或其毒素存在于血液或組織中，機體對感染產(chǎn)生的一種嚴重全身性炎癥反應(yīng)，是外科感染、重度創(chuàng)傷、大手術(shù)后、重型急性胰腺炎和休克等的常見并發(fā)癥，進一步加重可發(fā)展為嚴重膿毒癥,并發(fā)感染性休克、急性肺損傷（acute lung injury，ALI）、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distresssyndrome，ARDS）甚至多器官功能障礙綜合征（multiple organ dy

2、sfunction syndrome，MODS）。由革蘭陰性桿菌的胞壁成份—脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的內(nèi)毒素血癥則為最常見最典型的膿毒癥。肺臟是膿毒癥時最易受損的器官，急性肺損傷出現(xiàn)最早，發(fā)生率最高，表現(xiàn)為低氧血癥和呼吸窘迫。膿毒癥是ALI 高發(fā)病率和高死亡率的主要原因。肺毛細血管通透性增高是膿毒癥ALI的發(fā)病基礎(chǔ)和重要的病理生理特征，肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular e

3、ndotheliAlcell，PMVEC）的損傷起著關(guān)鍵性作用。PMVEC呈連續(xù)性襯在血管腔內(nèi)面，肺血管通透性依賴于其活性。
　　 越來越多的研究證明中性粒細胞和血小板積極參與膿毒癥炎癥反應(yīng)并在其過程中發(fā)揮協(xié)同作用，包括血小板參與免疫激活及協(xié)同中性粒細胞誘捕細菌。TLR4（Tol llike receptor 4，TLR4）屬于Tol l 樣受體家族成員，表達于多種不同類型的細胞，為LPS刺激后啟動促炎細胞因子的產(chǎn)生和相應(yīng)的免疫

4、反應(yīng)，是LPS的特異性跨膜受體。近年來對內(nèi)毒素血癥中血小板活化機制的研究認為，膿毒癥時血小板表達功能性TLR4，激活中性粒細胞形成中性粒細胞胞外菌網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）捕獲殺滅細菌；而血小板通過中性粒細胞依賴的方式首先聚集于肺毛細血管和肝血竇使血小板數(shù)量減少，進而導(dǎo)致肺和肝臟功能障礙甚至衰竭。
　　 膿毒癥ALI時，PMVEC的損傷是由LPS的直接作用，還是由血小板與中性粒細

5、胞的共同參與所致？血小板TLR4在此過程中發(fā)揮了怎樣的作用？其他細胞的TLR4是否在PMVEC 損傷作用中亦起到重要的作用？這些方面的研究未見報道。
　　 研究目的:
　　 本研究通過LPS 刺激體外培養(yǎng)的小鼠PMVEC，觀察血小板和（或）中性粒細胞對PMVEC 損傷的影響，探討離體條件下血小板LPS 特異性受體TLR4對小鼠膿毒癥ALI時PMVEC 損傷的介導(dǎo)作用；進而闡明血小板TLR4在膿毒癥ALI時的作用，為膿毒癥

6、ALI 機制的深入研究提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 1.原代培養(yǎng)小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞采用酶消化、免疫磁珠二次分選法分離純化小鼠PMVEC，貼壁培養(yǎng)法體外擴增，CCK-8 法測定細胞的生長情況，相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)，透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)，流式細胞儀對其表型進行鑒定。
　　 2.分別分離正常小鼠和TLR4 缺失小鼠的血小板及正常小鼠的中性粒細胞血小板分離：小鼠異氟烷持續(xù)吸入麻醉后心臟穿刺

7、以ACD （vol:vol 1:9）抗凝收集全血，約1.2～1.5ml/只，室溫下1500rpm 離心5min，取上層富含血小板血漿再以3000rpm 離心10min，沉淀即為血小板。所得血小板活化程度通過流式細胞儀檢測血小板表面CD41和CD62P/P-selectin的表達而測定，僅將未活化的血小板用于實驗。
　　 中性粒細胞分離：ACD抗凝血用小鼠中性粒細胞分離液進行分離，所得中性粒細胞活化程度通過流式細胞儀檢測其表面的L

8、y-6G和CD11b的表達而測定，僅將未活化的中性粒細胞用于實驗。
　　 3.實驗分組和處理取2～5代的PMVEC 以105/ml 接種于12孔板，5％ FBS，100U/100mg/ml 雙抗DMEM，37 ℃ 5％ CO2培養(yǎng)2d 左右，待細胞85％～90％融合即可用于實驗。將分離的血小板和中性粒細胞分別以終濃度約5×107/ml/孔和5×105/ml/孔與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)?！把“濉辈糠郑S機分為4組：對照組即內(nèi)皮細胞組（E

9、組）、內(nèi)皮細胞+血小板組（EP組）、內(nèi)皮細胞+中性粒細胞組（EN組）、內(nèi)皮細胞+血小板+中性粒細胞組（EPN組）；“血小板TLR4 ”部分，隨機分為2組：內(nèi)皮細胞+血小板+中性粒細胞組（EPN組）和內(nèi)皮細胞+TLR4 缺失血小板+中性粒細胞組（EP-/-N組）；每組分1h、6h、12h、18h、24h 5個亞組，每個亞組6孔，分別加入終濃度為1μg/ml的LPS，孵育。各亞組分別于第1、6、12、18和24h 收集上清液和內(nèi)皮細胞待測。

10、
　　 4.檢測指標①原代培養(yǎng)內(nèi)皮細胞鑒定：光鏡觀察細胞形態(tài)、電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)、流式細胞儀測定細胞免疫表型、CCK-8 法測繪細胞生長曲線。②流式細胞儀測定分離的血小板和中性粒細胞免疫表型。③光鏡觀察各組內(nèi)皮細胞處理后各個時間點的形態(tài)和數(shù)量改變。④DAPI 染色后熒光顯微鏡觀察處理后24h 各組內(nèi)皮細胞胞核變化。⑤流式細胞儀測定各組各個時間點內(nèi)皮細胞數(shù)量、損傷率和活化率。⑥流式細胞儀測定上清液細胞數(shù)量及活化率。
　　

11、 結(jié)論:
　　 1.建立了一種有效分離、純化、擴增小鼠PMVEC的方法。
　　 2.血小板在離體LPS 誘導(dǎo)的小鼠PMVEC 損傷中與中性粒細胞協(xié)同作用，且兩者缺一不可；P-selectin的表達不能作為離體條件下內(nèi)毒素血癥環(huán)境中血小板活化的特異性標志。
　　 3.血小板TLR4在離體LPS 誘導(dǎo)的小鼠PMVEC 損傷中促進內(nèi)皮細胞、中性粒細胞的活化及血小板、中性粒細胞的粘附，加重炎癥狀態(tài)下中性粒細胞對PMVEC